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丙型肝炎国产诊断试剂与第三代进口试剂的临床比较研究

来源:中华医学检验杂志 作者:祁自柏… 2009-2-21
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摘要: 【摘要】目的考察丙型肝炎(丙肝)国产改进酶标诊断试剂与国外第三代主流试剂的灵敏度与特异性。方法用改进后的国产新伟凯公司丙肝试剂(XWK)和两种国外第三代主流试剂(A3,O3)检测了2 882份供血员血样和556份各种肝炎病人血样。结果3种试剂(XWK,A3,O3)分别检出380,378和371份阳性样品,经免疫印迹条法(RIBA)和聚合酶链反......


摘要】 目的 考察丙型肝炎(丙肝)国产改进酶标诊断试剂与国外第三代主流试剂的灵敏度与特异性。方法 用改进后的国产新伟凯公司丙肝试剂(XWK)和两种国外第三代主流试剂(A3,O3)检测了2 882份供血员血样和556份各种肝炎病人血样。结果 3种试剂(XWK,A3,O3)分别检出380,378和371份阳性样品,经免疫印迹条法(RIBA)和聚合酶链反应(PCR)方法确证,3种试剂的假阳性数分别为7,6和1份,假阴性数分别为1,2和4份。结果说明,改进后的国产丙肝试剂,其检出灵敏度与目前国际上最新一代试剂接近,但其特异性略逊于国外两种第三代主流试剂。结论 分析RIBA和PCR所测得的3种试剂漏检样品的结果可以看出,目前国际上的第三代丙肝酶标试剂对丙肝核心抗体的检出灵敏度较低,这一点与我们以前的研究结果相同。而改进后的国产丙肝试剂既赶上了国外第三代试剂对丙肝NS3抗体的检出力度,同时又避免了国外试剂所暴露出的对丙肝核心抗体检出力弱的缺点。

  Evaluating Chinese anti-HCV EIA kit and foreign third-generation anti-HCV EIA kit Qi Zibai, Zhou Cheng, Gu Jinlian, et al. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050

  【Abstract】 Objective Toeevaluate the sensitivity and specificity of the improved Chinese anti-HCV EIA kit and foreign third-generation anti-HCV EIA kit.Methods 2 882 Chinese blood donors and 556 Chinese hepatitis patient sera were tested with the improved Chinese anti-HCV EIA kit (XWK) and two foreign third-generation anti-HCV EIA kits (A3,O3).Results The positive samples detected by XWK, A3 and O3 were 380, 378 and 371 respectively. According to the confirmed results by RIBA and PCR, the false positive samples given by XWK, A3 and O3 were 7, 6 and 1. And the false negative samples were 1, 2 and 4 respectively. The results showed that the sensitivity of the improved Chinese anti-HCV EIA kit was similar to that of the third-generation kit, but the specificity was poor than that of the late.Conclusion The conclusion also can be drawn that the capability of A3 and O3 in detecting anti-HCV core antibody is poor.

  【Keywords】 Hepatitis C  Reagent kits, diagnostic  Polymerase chain reaction

  丙型肝炎(丙肝)病毒(HCV)于1989年被发现以来[1],国外的丙肝酶标诊断试剂(抗HCV EIA)已发展到第三代。我国于第八个五年计划期间组织了科研攻关,建立了丙肝诊断试剂国家参考品,于1993年生产出了自己的丙肝酶标诊断试剂[2,3]。为推动我国丙肝诊断试剂质量的提高,我们又研制出了我国丙肝诊断试剂第三代国家参考品,并对国产丙肝诊断试剂进行了改进。目前,经过改进的,达到国家第三代参考品要求的新伟凯公司丙肝试剂已大量投放市场。为调查该丙肝试剂的使用效果,我们将改进后的国产抗HCV EIA试剂与国外的两种主流第三代丙肝试剂(A3、O3)进行了临床比较研究,并对可疑样品用免疫印迹条法(RIBA),聚合酶链反应(PCR)等方法进行了确证。现将结果报告如下。

材料和方法

  一、样品

  从北京市、内蒙古自治区、山东省、辽宁省、山西省、河南省、陕西省、四川省、云南省、广东省,贵州省收集供血员血样共2 882份;肝炎病人血样共556份,病人包括急性肝炎,肝硬化,慢性肝炎和肝癌病人等,也包括一部分怀疑为丙肝病毒感染者。

  二、试剂

  新伟凯公司HCV EIA(XWK)试剂(批号:970526)。两种国外主流第三代试剂:O3,HCV 酶联免疫吸附测定(ELISA)3.0试剂;A3,HCV EIA3.0试剂。RIBA(开隆公司)HCV3.0 SIA批号:MLM848。华美生物工程公司HCV RNA PCR-HYB试剂,批号:970103。卫生部肝炎试剂中心HCV RNA PCR试剂,批号971102。

  三、方法

  首先将新伟凯公司HCV EIA试剂用国家第三代参考品进行检定,合格后用于以下比较研究。

  O3试剂和XWK试剂对供血员和肝炎病人血样的检测在HAMILTON FAME自动酶标仪上进行。加样,孵育,洗涤,数据处理及结果打印均由仪器自动进行。A3试剂对血样的检测在该试剂专用酶标仪PPC上进行。并由该仪器专业工程师操作,全部自动检测并打印结果。凡以上3种试剂(O3,A3和XWK试剂)检测阴阳性结果不一致的样品,用原来试剂分别作双份重试,若重试后3种试剂仍不能得出一致结果,则对该样品用RIBA和PCR作进一步确证。RIBA HCV 3.0的检测由该试剂的专用自动检测仪PROCESSOR完成。该仪器自动加样,保温,洗涤并打印结果。对样品中的HCV RNA的测定,用华美公司HCV RNA杂交PCR试剂(HCV RNA PCR-HYB)进行检测,并同时将部分可疑样品送卫生部肝炎试剂中心用双盲法复核。

  四、抗HCV阳性样品判定标准

  1.3种EIA试剂检测结果均为阳性的样品,定为阳性样品。

  2.3种试剂中的一种或两种检测为阳性,而其他试剂检测为阴性的样品,用RIBA HCV3.0和HCV RNA PCR试剂作进一步确证:(1)当样品与RIBA试剂中的两种或两种以上HCV抗原呈阳性反应时,按照RIBA说明书规定,该样品为阳性样品。(2)当样品与RIBA试剂中的一种HCV抗原呈阳性反应,而HCV RNA为阳性时该样品为阳性样品。

结果

  由于酶标试剂的测定均在专用的自动酶标仪上进行,仪器记录下了每一步的操作过程,保证了测定的准确性和可重复性。HCV RNA的检测用杂交PCR试剂,经卫生部肝炎试剂中心复核结果一致。这就保证了本文数据的可信性。试剂的初步阳性率和复试阳性率的差别是衡量试剂质量的一个重要指标。本文所考核的3种试剂的初试和复试结果非常接近(其符合率均大于98%),说明该3种试剂的重复性均较好。

  在2 882份供血员血样中,XWK试剂检出42份阳性,O3试剂检出40份阳性,A3试剂检出41份阳性。在556份各种肝炎病人血样中,XWK试剂检出阳性数为338,O3试剂为331,A3试剂则为337。3种试剂的阳性率基本相似,其差异无显著意义。

  根据EIA试剂检测数据及RIBA和PCR确证结果,按照材料与方法部分所述阳性样品判定原则,在总共3 438份样品中,阳性样品为374份,阴性样品为3 064份。XWK试剂及A3、O3试剂对供血员和肝炎病人血样检测结果及阴阳性符合情况如下:

  1.XWK试剂共测出380份阳性样品,其中373份为真正的阳性样品,7份为非特异假阳性样品。在试剂所测出的3 058份阴性样品中,3 057份为真正的阴性样品,1份应为阳性样品,即该试剂对该份样品出现了漏检。阳性符合率为99.7%(373/374),阴性符合率为99.7%(3057/3064),总体符合率为99.7%。

  A3试剂共测出378份阳性样品,其中372份为真正的阳性样品,6份为非特异假阳性样品。在所测出的3 060份阴性样品中,3 058份为真正的阴性样品,2份为假阴性样品,即该试剂对该2份样品发生了漏检。阳性符合率为99.4%(372/374),阴性符合率为99.8%(3 058/3 064),总体符合率为99.7%。

  在O3试剂所测出的371份阳性样品中,370份为真正的阳性样品,1份为非特异假阳性样品。而在所测出的3 067份阴性样品中,3 063份为真正的阴性样品,其余的4份实际应为阳性,即该试剂对这4份样品发生了漏检。阳性符合率为98.9%(370/374),阴性符合率为99.9%(3 063/3 064),总体符合率为99.8%。

  3种试剂的阳性符合率,阴性符合率,总体符合率均大于95%,相互之间的差异无统计学意义。即说明我们目前经过改进后的新伟凯试剂与国际上的第三代主流试剂在检出率及特异性方面基本类似。但新伟凯试剂虽在阳性检出率方面不低于A3和O3试剂,但其非特异假阳性出现的频率略高于国外的A3和O3试剂。

表1 XWK,A3,O3三种试剂假阴性(漏检)样品

样品 A3 O3 XWK RIBA-3.0 PCR 假阴性
C100p,

  5-1-1p

C33c C22p NS5
C62 + + - 2+ - - 3+ 3+ XWK
B19 - - + - - 4+ - + A3 O3
HM3 - + + - 2+ 1+ - - A3
SY22 + - + +/- +/- 2+ - + O3
Bp50 + - + - - 3+ - + O3
Bp46 + - + - +/- 4+ - + O3

  注:“+”为阳性,“-”为阴性(下表同)

表2 XWK,A3,O3三种试剂假阳性(非特异)样品

样品 A3 O3 XWK RIBA-3.0 PCR 假阳性
C100p,

  5-1-1p

C33c C22p NS5
C83 - - + - - - - - XWK
C85 - - + - - - - - XWK
W286 - - + - - - - - XWK
724 - - + - - - - - XWK
W35 - - + - - - - - XWK
LN163 + - + - - - - - XWK,A3
W95 + - + - - + - - XWK,A3
LN95 + - - - - - - - A3
ZSY3 + - - - - - - - A3
ZSY61 + - - - - - - - A3
ZSY64 + - - - - - - - A3
PX638 - + - - - - - - O3

  2.3种试剂所出现的假阴性(漏检)和假阳性(非特异)样品的确证结果,分别见表1,2。

  XWK试剂出现1份假阴性样品C62(表1)。该份样品与RIBA 3.0中的NS4(C100p+5-1-1p)和NS5两种HCV抗原发生阳性反应,其HCV RNA亦为阳性。按照RIBA 3.0的说明书,该份样品应为抗HCV阳性样品。A3和O3试剂对该份样品呈阳性反应。根据A3和O3试剂的说明书,该两种试剂所包被的HCV抗原中,均含有NS5抗原,而XWK试剂目前尚未包被NS5抗原,因此对这份含有抗NS5抗体血样的漏检就在情理之中了。XWK试剂出现非特异假阳性反应的7份样品(C83,C85,W286,724,W35,LN163,W95,表2),经RIBA和PCR确证均为阴性,其中的两份(W95,LN163)A3试剂亦出现了假阳性。W95号样品虽与RIBA试剂中的C22p抗原发生了弱阳性反应,但其HCV RNA为阴性,根据RIBA说明书及公认的阳性样品判定标准,该样品应为阴性。

  A3试剂出现了2份漏检(B19,HM3,表1),样品B19与RIBA中的HCV核心抗原(C22p)发生了强阳性反应,且其HCV RNA为阳性。样品HM3与RIBA中的NS3(C33c)和核心(C22p)抗原发生了阳性反应,根据以上标准该两份样品应为阳性样品。A3试剂所出现非特异假阳性反应的6份样品被列入表2(LN163,W95,LN95,ZSY3,ZSY61,ZSY64)。其中除W95在RIBA检测中出现了1条弱阳性带(已在前面提到)以外,其RIBA和PCR检测均为阴性。

  O3试剂发生漏检的有4份样品(B19,SY22,Bp50,Bp46,表1)。除1份样品(B19)A3试剂亦显示阴性结果以外,均被XWK和A3试剂检出。而该4份样品在RIBA检测中,均与HCV核心抗原(C22p)发生了强阳性反应,而与其他HCV抗原(NS3,NS4,NS5)不发生反应或可疑阳性反应,其HCV RNA均为阳性。这说明O3试剂对抗HCV核心抗体的检出灵敏度不够。这与我们以前的发现是一致的。与XWK和A3试剂相反,O3试剂虽出现了较前两种试剂多的漏检样品,但仅对1份样品发生了非特异反应(PX638,表2)。

讨论

  从以上结果可以看出,经过最近改进后的国产酶标诊断试剂与国际上的最新一代的丙肝诊断试剂相比,在供血员和肝炎病人中的检出率已比较接近(漏检数:XWK试剂1份,A3试剂2份,O3试剂4份),但其特异性略逊于国外2种第三代主流试剂(非特异数:XWK试剂7份,A3试剂6份,O3试剂1份)。

  丙肝病毒尚不能体外培养,要想得到大量丙肝天然抗原几乎是不可能的。目前用于制造丙肝试剂的丙肝抗原主要用基因工程表达和多肽合成方法得到。用什么区段的丙肝病毒抗原蛋白,怎样保持他们的天然生物活性,如何选择各种抗原合适的比例,以保证测出样品中所有的抗HCV抗体成了制造HCV试剂的关键因素。国外的第二代试剂使用HCV核心和NS3抗原,第三代试剂增加了NS5抗原[4]。根据文献报道和我们的研究(资料待发表),第三代试剂较第二代试剂的检出率提高,尤其是对NS3抗体的检出灵敏度大大提高,但与第二代试剂相比,对核心抗体的检出力度有所下降。本工作的结果再次证明了这一点。但各种第三代试剂下降的程度略有不同,根据A3和O3试剂的说明书,O3试剂使用了基因工程表达的HCV核心抗原(AA2-120),而A3试剂使用了基因工程表达的两种HCV核心抗原(AA1-150和AA1-150+1192-1457)。这就解释了为什么虽然2种国外第三代试剂对HCV核心抗体的检出力度都有下降,但O3试剂下降的程度更大的原因。我们在研制国产第三代参考品的时候,考虑到了这一现象,希望我们改进后的国产丙肝试剂在提高对HCV NS3抗体检出率的同时,不能降低对HCV核心抗体的检出力度。现在看来这一目的基本达到了。

  自国外第三代试剂问世以来,国际上对试剂中增加HCV NS5抗原始终存在争议[5],我国也没有规定试剂中必须加入HCV NS5抗原。我们发现国产试剂所漏检的1份样品(C62,表1),以抗NS4和NS5为主,这一现象提醒我们应进一步加强对NS5抗原作用的研究。

  另外需要指出的是,虽然从本文数据来看,国产试剂与国外试剂在灵敏度和特异性方面差距不大,但在我们操作的过程中体会到,国外试剂的阴性和阳性样品A值的差距较国内试剂明显大,A值落在临界值附近的样品较国内试剂少得多。国外试剂对操作人员和实验室的要求也较国产试剂宽松。这说明国产试剂不但在特异性方面需要改进,在试剂的组装技术方面也存在待改进之处。

  本课题受国家九五科技攻关基金资助(编号969060306)

  参考文献

  1 Choo QL, Kuo G, Weiner A J, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-born non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 1989,244:359-362.

  2 金容玉,周诚,苏涛,等.丙型肝炎诊断试剂质控参考品的建立.中国生物制品学杂志,1994,7:18-23.

  3 金容玉,祁自柏,周诚,等.第二代丙型肝炎诊断试剂质控参考品的建立.中华医学检验杂志,1994,4:207-211.

  4 Lee S R, Wood C L, Lane M J, et al. Increased detection of hepatitis C virus infection in commercial plasma donors by a third-generation screening assay. Transfusion, 1995,35:845-849.

  5 Uyttendaele S, Claeys H, Mertens W, et al. Evaluation of third-generation screening and confirmatory assays for HCV antibodies. Vox Sang, 1994,66:122-127.



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