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组织相溶性抗原基因分型中三种DNA快速抽提法比较

来源:中华医学检验杂志 作者:王晓波… 2009-2-21
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摘要: 血液DNA抽提的质量和速度是影响组织相溶性抗原(HLA)基因分型效果的一个主要因素,目前普遍采用的标准酚-氯仿抽提法,因耗时较长,难以满足临床需求。现将NP-40法、辛酸法与标准酚-氯仿抽提法对比研究结果报告如下。一、资料和方法本工作以30份全血及15份淋巴细胞为研究标本。DNA提取方法有3种:1。...


血液DNA抽提的质量和速度是影响组织相溶性抗原(HLA)基因分型效果的一个主要因素,目前普遍采用的标准酚-氯仿抽提法,因耗时较长,难以满足临床需求。为此,我们建立了NP-40法及辛酸法,进一步缩短时间,简化了操作步骤。现将NP-40法、辛酸法与标准酚-氯仿抽提法对比研究结果报告如下。

  一、资料和方法

  本工作以30份全血及15份淋巴细胞为研究标本。(1)全血标本为新鲜或冻存的乙二胺四乙酸(EDTA)或酸-枸橼酸-葡萄糖(ACD)抗凝血3 ml。(2)淋巴细胞为HLA-A、B抗原血清学分型或淋巴细胞毒交叉试验中剩余的淋巴细胞。DNA提取方法有3种:

  1.标准酚-氯仿提取法:按常规方法进行(具体步骤略)。

  2.NP-40法:根据John等报道的NP-40法,进行部分改进。其步骤简述如下:取EDTA抗凝血0.5 ml,加0.5 ml溶液Ⅰ(10 mmol/L Tris-盐酸,10 mmol/L氯化钾,10 mmol/L 氯化镁),加入16 μl NP-40混匀;3 000×g低速离心10分钟,去上清液,加80 μl溶液Ⅱ(10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L氯化钾,10 mmol/L氯化镁,0.5 mol/L氯化钠,0.5%SDS,2 mmol/L EDTA)悬浮沉淀;以下进行酚-氯仿抽提(步骤同标准酚-氯仿抽提法)。

  3.辛酸法:在Planelles等的方法进行部分改进:取EDTA或ACD抗凝血1 ml,加Triton X-100 20 μl,翻转混匀4~5次,13 000×g离心10秒;去上清,加500 μl三蒸水、500 μl磷酸盐缓冲液、100 μl 2%脱氧胆酸钠混匀,13 000×g离心30秒;去上清,沉淀加2mol/L NaCl 1 ml,10%SDS 50 μl,辛酸(预稀释成工作浓度,无水乙醇:辛酸=5∶1)50 μl震荡1分钟,13 000×g离心1分钟;取下层水相加1 ml无水乙醇沉淀DNA,以70%乙醇洗2次,以三蒸水100 μl溶解DNA(60℃助溶5分钟即可使用)。

  统计学处理,多组间均数的比较用方差分析。

  二、结果

  1.DNA的含量及纯度测定:30份EDTA或ACD抗凝血标本分别采用以上3种方法进行DNA抽提,以岛津UV-240紫外光法测定DNA的含量及260 nm/280 nm的吸光度(A)值比率,DNA的量按1 ml全血所提取的DNA量计算(附表)。

附表 3种PCR模板制备方法的DNA含量、纯度、扩增效果

  及所需时间的比较(x±s)

方  法 DNA含量(μg) A260/280nm 时间(min)
标准酚-氯仿 18.5±4.1 2.01±0.30

840

NP-40 17.2±3.2 1.98±0.19 60
辛酸 18.7±4.1 2.02±0.30 20
三组间均数比较P值 >0.05 >0.05

  2.提取DNA的琼脂糖凝胶电泳结果:3种方法所提取的DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,所提DNA带型整齐,提示DNA均无明显降解。

  3.HLA基因分型效果:采用PCR-SSP法对3种方法制备的30份DNA标本进行HLA-DR基因分型,3种方法均很稳定,扩增成功率100%(附表),同一标本中不同方法提取DNA的基因分型结果一致;另外分别采用NP-40和辛酸法对15份淋巴细胞标本进行DNA抽提也均获成功,扩增效果满意,HLA基因分型结果与其全血标本完全一致。

  4.3种DNA制备方法所需时间见附表。

  三、讨论

  HLA基因分型技术目前已广泛应用于临床器官移植,但由于模板DNA的制备耗时太长,使之难以完全满足临床的需要。标准的酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一,但该法耗时长,影响了临床应用。我们探索了几种抗凝血标本DNA模板的快速制备方法,发现煮沸法虽快捷(30分钟),但结果不稳定,重复率不高;NP-40法和辛酸法则是理想的血液DNA模板快速制备的方法,所需时间分别为60分钟和20分钟,操作简单,所需试剂方便易得,结果稳定。通过对30份血标本DNA的提取,并与酚-氯仿法同步对比研究,所提取DNA的量和纯度与标准酚-氯仿抽提法相比无明显差异,DNA分子完整,无明显降解。3种方法提取DNA的HLA-DR基因分型结果一致。对分离出的淋巴细胞标本DNA的提取也同样获得满意结果。

  尽管辛酸法较NP-40法更为快捷,但对冻存较久(1个月以上)的全血标本不如NP-40法稳定。因此,对新鲜血或淋巴细胞标本,我们多采用辛酸法,两者各有其特点,在临床检测中可结合使用。

  本研究显示辛酸法和NP-40法可满足临床快速HLA基因分型的需要,不仅如此,本方法对所有血液DNA分子生物学的科研及临床检测项目均具有很广泛的应用价值。



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