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人类T淋巴细胞病毒Ⅰ及Ⅱ型感染的检测

来源:中华医学检验杂志 作者:姚苹孙… 2009-2-21
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摘要: 人类T淋巴细胞病毒(HTLV)-Ⅰ与成人T淋巴细胞白血病(ATL)感染有关,HTLV-Ⅱ和T细胞性毛细胞白血病(THCL)感染有关。在世界许多地区均有HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ感染,并在某些地区流行的报道,流行地区人群的感染率可高达10%。由于HTLV可通过输血感染,与患者密切接触人群的感染率也较其他人群高,故对献血者及患者HTLV的检测,......


近年来,随着基础和边缘各学科的迅猛发展,我国的医学检验领域也发生了可喜的变化,取得了长足的进步。在成绩面前,我们仍应冷静地看到距离国际先进水平的较大差距。新理论的不断问世,新技术设备的采纳应用,对各级医学检验专业人员都是一种机遇和挑战,使我们越来越感到,尽快了解和掌握现代医学检验新理论新技术的重要性和紧迫性。为了满足广大读者知识更新的迫切要求,发挥我刊的学术导向作用,本刊编委会决定,从本期开始,将“继续教育园地”专栏奉献给广大读者。具体报名办法,详见本期第70页。热诚欢迎您踊跃报名参加学习,并给我们的工作提出宝贵的意见和建议。

  人类T淋巴细胞病毒(HTLV)-Ⅰ与成人T淋巴细胞白血病(ATL)感染有关,HTLV-Ⅱ和T细胞性毛细胞白血病(THCL)感染有关。在世界许多地区均有HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ感染,并在某些地区流行的报道,流行地区人群的感染率可高达10%。由于HTLV可通过输血感染,与患者密切接触人群的感染率也较其他人群高,故对献血者及患者HTLV的检测,在控制病毒感染及传播方面具有重要意义。目前将HTLV分为两个型, 即HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ。以往曾将人类免疫缺陷病毒(HIV)划分为HTLV第三型(HTLV-Ⅲ),此分类法不再沿用,现已将HIV归属于逆转录病毒科慢病毒亚科。

  一、HTLV感染与相关的疾病

  1.病原结构:HTLV是逆转录病毒科肿瘤病毒亚科中唯一能引起人类疾病的病毒。HTLV为球形颗粒,直径约80~130 nm。内部由RNA、核蛋白及围绕在外面的20面体蛋白衣壳组成,直径为40~60 nm,病毒最外层具有包膜结构,表面嵌有糖蛋白。病毒基因主要有gag、pol、env、pX。gag主要编码3种核心蛋白p19、p24、p15;pol主要编码病毒的逆转录酶、整合酶,核酸酶H;env编码包膜糖蛋白gp46和穿膜糖蛋白p21e;病毒的pX基因主要编码3种非结构蛋白:p40tax, p27rex 和p21X。以上基因及蛋白在临床的检测中具有重要意义[1,2]

  2.HTLV感染概况:HTLV流行地区和非流行地区的人群感染率不同[3]。在流行地区,无症状的病毒携带者抗体阳性率明显高于非流行地区,如日本北部Hokkaido非流行地区的抗体阳性率为0%,而西南部Nagasaki和 Kagoshima流行地区人群抗体阳性率分别为16% 和15%,并有明显的聚集发病趋势。加勒比海盆地是HTLV的另一个流行地区,牙买加的非何杰金恶性淋巴瘤患者约70% HTLV-Ⅰ抗体阳性。牙买加健康人群抗体阳性率约2%~10%,海地的健康人群抗体阳性率估计还要高些。英国加勒比海盆地移民中,患ATL的黑色人种近乎100% HTLV-Ⅰ抗体阳性。非洲南部和北部也是HTLV感染的高发区。南非、尼日利亚、埃及、北非和加纳等国中,正常人群HTLV-Ⅰ的抗体水平为2%~10%。另外在美国和以色列也存在小范围流行。我国福建省也有HTLV-Ⅰ小流行的报道[4]

  在非流行国家,健康者HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ携带率不高,一般低于2%。资料表明病毒可通过供血者传播,有多次输血史的人群HTLV-Ⅰ、Ⅱ的受染率分别为10.2% 、0.8%[5]。有学者认为,非T细胞白血病或淋巴瘤患者,或是儿童白血病HTLV-Ⅰ的感染可能是由于输入污染有HTLV-Ⅰ的血制品造成。虽然输有HTLV血液的受血者可能不发病,但作为携带个体,可能通过分娩、哺乳、性接触等途径,成为病毒传播的重要传染源。

  3.与HTLV相关的疾病:目前已从许多T淋巴细胞的恶性疾病中分离到HTLV,如成人T细胞白血病(ATL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、T细胞性毛细胞白血病(THCL)、播散性混合性淋巴瘤(DML)等。此外,从艾滋病、某些慢性神经系统的退行性病变的组织及健康人中也分离到HTLV。

  研究显示,HTLV-Ⅰ是T淋巴细胞白血病或淋巴瘤的病原因子[6,7],血液或组织中的肿瘤细胞以CD+4、CD-8为主。另外在感染HTLV-Ⅰ后,可出现HTLV-Ⅰ相关的脊髓病或热带痉挛性下肢轻瘫(HAM/TSP)[8,9]。HAM/TSP是一种慢性、进行性神经性疾病,表现为脊髓退行性病变,并在外周血和脑脊髓液中出现CD+8细胞毒T淋巴细胞的浸润。

  虽然多次从T细胞性毛细胞白血病患者中分离到HTLV-Ⅱ,HTLV-Ⅱ也能在体外转化人的正常T细胞,但病毒在体内致病机理尚不明了,故目前仍不能十分确定HTLV-Ⅱ作为致病因子可造成淋巴细胞增殖性疾病[10]

  二、HTLV检测方法的应用

  HTLV感染的检测大致分为对患者血清中抗体的测定和对组织或细胞中病毒蛋白或病毒基因的检测,另外还可以利用细胞培养的方法对标本进行病毒分离。

  1.中和试验(NT):目前中和试验主要用于检测人群或某些患者血清中的特异性中和抗体,抗原多采用病毒包膜糖蛋白。HTLV-Ⅰ特异性中和抗体在HAM/TSP患者的血清中最易检测到(100%),而ATL患者血清的检出率为50%,无症状HTLV-Ⅰ的携带者(AS)检出率为83%,不同人群的血清平均滴度也存在明显的差异(ATL<AS<TSP/HAM)[11]

  2.胶质颗粒被动血凝试验(PA):有报告用胶质颗粒被动血凝试验检测了28 897份血液捐献者的血清抗体[12],经重复试验的阳性标本,再用蛋白转印技术(Western blot)方法验证并区分不同型。结果显示:用PA 检测有47份标本抗体阳性,经Western blot验证后,有13份标本确定为HTLV感染,其中10份HTLV-Ⅰ抗体阳性,2份HTLV-Ⅱ抗体阳性,1份不能确切分型,21份无反应性,13份不能确定。

  3. 酶联免疫吸附试验(ELISA):ELISA主要用于血清中病毒特异性抗体的检测,抗原多采用病毒特异性蛋白,如gp46、p21e、p40tax、 p27rex 和p21X。有学者对2 430份血清进行了ELISA检测,标本来自152例T淋巴细胞疾病,250例B淋巴细胞异常,67例骨髓性白血病,41例何杰金病,351例有多次输血史,235例有不同类型的实体瘤,109例为HTLV-Ⅰ感染患者的家庭成员。用ELISA实验筛选,并用Western blot和聚合酶链反应(PCR)重复检测以区别HTLV-Ⅰ和 HTLV-Ⅱ 。血清流行病学显示,HTLV-Ⅰ感染在淋巴系统的恶性肿瘤中比例较高(28.9%),并主要见于T细胞性疾病。 在供血员中HTLV-Ⅰ 和HTLV-Ⅱ的感染率分别为0.4% 及0.1%,有多次输血史的人群受染率分别为10.2% 、0.8%, HTLV-Ⅰ或 HTLV-Ⅱ感染患者的家庭成员的感染率为27.5%[5]

  对于病毒的非结构蛋白,除了用p40tax作为抗原,还利用p21X与 p27rex C末端蛋白相同,将p21X蛋白的基因合成产物作为通用抗原。有人采用这种抗原经竞争ELISA法对31例 ATL患者,30例无症状携带者,18例 HAM 患者和100名健康供血者进行p27rex 和p21X检测。结果显示ELISA的敏感性比Western blot高将近100倍。在HTLV-Ⅰ感染的个体血清中具有抗p21X/p27rex 抗体的百分比为3.8%[1]

  4.Western blot技术:用Western blot检测HTLV,主要是通过转印技术将病毒标准株的特异性蛋白电泳带转移到特定载体上,再与患者血清进行反应,从而达到检测患者血清中HTLV特异性抗体的目的。Western blot主要用于血清筛选后的验证试验,也是HTLV和HIV鉴别诊断的主要方法之一。用Western blot方法检测巴西圣*保罗351 639供血员的HTLV感染状况,结果显示HTLV-Ⅰ/Ⅱ阳性者为1 063例(0.30%),其中2 238 不能确定(0.63%)。PCR检测供血员的外周血单核细胞中pol和 tax 序列,证实所有Western blot检测血清阳性的供血员均为HTLV-Ⅰ/Ⅱ感染,血清检测不确定的供血员PCR检测均为阴性[13]

  5.PCR:PCR主要用于检测标本中整合的病毒基因序列,如病毒基因两端的长末端重复序列(LTR),gag、pol、env和tax 序列等。有报道用套式PCR检测HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ阳性患者的细胞系(MT-2、C3/44Mo)和外周血单核细胞(PBMINC)中的pol和env基因区,原作者认为这种方法适用于就诊期病人及血清诊断不明的患者[14,15]。 也有用原位逆转录-PCR(RT-PCR/ISH)检测具有不同临床症状患者标本中HTLV-Ⅰ整合的原病毒DNA、tax或(和)rex mRNA[16],结果显示ATL患者40%~60%有核细胞HTLV-Ⅰ原病毒DNA阳性,而ATL患病初期阳性细胞为1%~5%,tax或(和)rex mRNA表达的阳性细胞数少于原病毒DNA阳性细胞,这可能与HTLV-Ⅰ的感染和激活随T辅助细胞恶性转化而不断增加有关。PCR对整合原病毒DNA的检测有助于动态观察患者病程,并对患者的预后作出合理的评价。

  6.病毒分离:HTLV的分离一般采用两种方法,一是对患者外周血中T细胞的直接培养,二是感染细胞与正常T细胞的混合培养[17,18]

  直接培养是用淋巴细胞分离液从患者血液中获得淋巴细胞,经植物血凝素(PHA)与细胞共育,再加入T细胞生长因子(IL-2),培养3~6周。若病毒处于增殖期,可用免疫电镜的方法在感染的T细胞中直接观察病毒颗粒,也可利用标准血清,通过间接免疫荧光染色法检测细胞中的病毒抗原。如果由于病毒以原病毒DNA的形式整合在细胞中,观察不到病毒颗粒时,可选用针对病毒核酸的相应检测方法。

  混合培养是先从正常血液中获得淋巴细胞,再加入患者的淋巴细胞共同培养。混合培养多用于观察病毒对正常T细胞的转化作用。HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ在体外均能转化人的T细胞,使其具有肿瘤无限增殖的生长特性。转化细胞中的HTLV检测方法与直接培养的病毒检测方法相同。

  目前临床对HTLV-Ⅰ或(和)Ⅱ感染的检测多采用抗体检测法和外周淋巴细胞病毒核酸检测法。对患者血清中抗体的检测,主要采用中和试验、ELISA和Western blot。中和技术由于在不同临床症状患者具有不同的检出率,故比较适合对那些患有与HTLV感染相关的慢性神经性疾病患者和病毒的健康携带者。ELISA采用的包被抗原种类不同,检出结果可能会存在一定差异。现采用最多的抗原是gp46,p21e,p24 和p40tax。ELISA的敏感性高,但由于其特异性, 适用于筛选试验,确诊要依据Western blot的结果。Western blot除了用于对患者血清中抗体的检测,还可以利用单克隆抗体对标本中相应的病毒蛋白成分进行检测。Western blot特异性高,但敏感性不如ELISA,两种方法的联合应用,不仅能提高标本的检出率,也能保证检出结果的特异性。

  HTLV感染后病毒基因在细胞内的整合形式决定了PCR引物的选择。在大多数ATL标本中存在完整的原病毒DNA,但在部分情况下病毒的整合基因却只包含LTR和env。另外,gag和pol的某些序列可能与肿瘤病毒亚科的其他病毒具有同源性。故在用PCR检测HTLV基因时,建议采用两种不同基因的引物,其中包括LTR或env。

  参考文献

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  3 Yamashita M,Ido E,Miura T,et al. Molecular epidemiology of HTLV-Ⅰ in the world. J Acquir Immunol Defic Syndr Hum Retrovirol, 1996,13 (Suppl 1): 124-131.

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  15 Vallejo A, Garcia SA. Typing human T-cell lymphotropic virus (HTLV-Ⅰ and HTLV-Ⅱ) by nested polymerase chain reaction: application to clinical specimens. J Virol Methods,1995, 51: 9-17.

  16 Ohshima K, Suzumiya J, Izumo S, et al. Detection of human T-lymphotropic virus type-I DNA and mRNA in the lymph nodes; using polymerase chain reaction in situ hybridization (PCR/ISH) and reverse transcription (RT-PCR/ISH). Int J Cancer,1996,66: 18-23.

  17 李影林,主编.临床微生物学及检验.北京:人民卫生出版社,1995.556-559.

  18 Martin TC,Southern PJ. Infection and cellular activation by human T-cell leukemia viruses, types Ⅰ and Ⅱ. Virology,1996,221:375-381.

  思考题

  1.人类T淋巴细胞病毒感染分哪几型?

  2.HTLV Ⅰ、Ⅱ型感染后发生什么疾病?

  3.HTLV Ⅲ型是否为HIV(人类免疫缺陷病毒)?HIV病毒与HTLVⅠ、Ⅱ型有何异同?

  4.目前对HTVLⅠ、Ⅱ感染的主要血清学检测方法有哪几种及各自的适用范围?

  5.用聚合酶链反应(PCR)检测HTLVⅠ、Ⅱ感染中哪些相关的病毒基因序列,选择引物要注意什么?

  6.HTLV的分离方法有哪些?分离后如何检测病毒?



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