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检测艾滋病患者滤纸干血斑标本中的HIV-1DNA

来源:中国医学科学院学报 作者:范雪莉… 2009-2-21
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摘要: 目的为适应艾滋病大面积流行病学筛查的需要,建立一种简便、可靠的采集标本、检测HIV-1感染的方法,以尽早发现处于“窗口期”、婴儿期及基层边远地区的感染者。方法滤纸干血斑标本的收集:模拟现场情况,采集经确证的艾滋病患者或HIV-1感染者和健康对照者的外周血标本,滴血样于新华定性滤纸上,平均点样量50μl,干燥后密......


目的 为适应艾滋病大面积流行病学筛查的需要,建立一种简便、可靠的采集标本、检测HIV-1感染的方法,以尽早发现处于“窗口期”、婴儿期及基层边远地区的感染者。

  方法 滤纸干血斑标本的收集:模拟现场情况,采集经确证的艾滋病患者或HIV-1感染者和健康对照者的外周血标本,滴血样于新华定性滤纸上,平均点样量50μl,干燥后密封保存并运输至检测实验室。将滤纸干血斑打孔制备成一定大小(7~8mm)的圆形纸片,分装在Eppendorf管,分别于-20℃、4℃或37℃保存,在第1、4、8、20周时进行样品处理及基因扩增。DNA样品的提取:向Eppendorf管中加入1ml裂解缓冲液处理3次后,吸去含血红蛋白的上清;沉淀中再加入50μl1.5倍PCR缓冲液,经涡旋震荡及高温处理后离心沉淀,洗出上清液即DNA样品用于基因扩增。巢式聚合酶链反应:首先用人类β-珠蛋白基因的引物对艾滋病患者或HIV-1感染者及健康对照的DNA样品进行扩增,出现阳性扩增信号的标本再用HIV-1gag基因的外引物与β-珠蛋白基因共同扩增;然后以扩增产物为模板,再加入gag基因的内引物进行二次巢式扩增。PCR反应条件与常规操作相同,扩增产物的检测采用2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后观察结果。

  结果 首先对艾滋病患者或HIV-1感染者及正常对照者的DNA样品进行β-珠蛋白基因扩增,两种样品均出现阳性扩增条带(268bp)。但延长电泳时间,凝胶中的电泳条带出现弥散现象;当进行β-珠蛋白基因和HIV-1gag基因外引物的双重扩增时,艾滋病患者或HIV-1感染者的DNA样品出现两种特异性扩增条带268bp和372bp,但后者较弱且弥散;扩增产物再用HIV-1gag基因内引物扩增,则出现较为清晰的扩增条带(255bp)。无论滤纸干血斑标本保存于-20℃、4℃、37℃或分别在第1、4、8、20周时进行基因扩增,扩增效率均未随温度和时间变化发生明显改变。健康对照的DNA样品除β-珠蛋白基因扩增阳性外,HIV-1gag基因的内外引物扩增均为阴性。

  本研究表明,滤纸干血斑是标本采集及运输的极好载体,具有稳定、简便、安全可靠的特点。即使在不同温度下保存20周之久,DNA结构仍保持稳定未发生降解。该标本处理过程快速、不需特殊试剂,经缓冲液处理两次后,样品即可用于扩增。巢式聚合酶链反应敏感、特异,能使滤纸干血斑标本中的痕量DNA得到有效扩增。

  随着全球范围艾滋病病例的增加,我国发现的人类免疫缺陷病毒感染病例也日益增多且已引起专家们的高度重视。由于HIV-1感染“窗口期”的存在及母婴传播率的增加,血清抗体检测因不能确定这些接触者是否被感染而显现其局限性。PCR检测标本中的HIV-1前病毒DNA,可以发现血清抗体阴性或假阴性的感染者。本法采用两次裂解标本、两次扩增策略,可获得高质量的DNA样品并得到有效扩增,减少现场操作步骤,为艾滋病的分子流行病学研究提供方便。



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