当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 临床医学与专科论文 > 检验医学 > 酶联免疫吸附试验检测HCVNS3-4A蛋白酶活性

酶联免疫吸附试验检测HCVNS3-4A蛋白酶活性

来源:中国医学科学院学报 作者:陈湘红… 2009-2-21
336*280 ads

摘要: 摘要目的建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)NS3-4A丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HCV蛋白酶抑制剂。方法将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的NS3/NS3-4A融合蛋白,用Western blot分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。......


摘 要 目的 建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)NS3-4A丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HCV蛋白酶抑制剂方法 将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的NS3/NS3-4A融合蛋白,用Western blot分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 SDS-PAGE电泳分析并用考马斯亮蓝染色,显示相对分子质量112 000和116 000处有麦芽糖结合的NS3及NS3-4A融合蛋白带出现;Western blot分析表明,表达的产物可与抗NS3蛋白的单克隆抗体发生阳性反应。ELISA证实HCV NS3-4A蛋白酶能使特异底物裂解。正交实验获得ELISA的最佳实验条件,其P/N值为3.63,批内和批间变异系数(CV)分别为4.16%和7.52%。此方法测定1,4萘醌对HCV蛋白酶活性50%抑制浓度(IC50)为8.36 μmol/L。结论 建立的ELISA方法,用于测定HCV蛋白酶活性,具有简便、快速、重复性好等特点,为以HCV NS3-4A蛋白酶为靶酶的抑制剂筛选及抗HCV药物的研究奠定了基础。

  关键词:丙型肝炎病毒 酶联免疫吸附试验 NS3/NS3-4A融合蛋白酶

  丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是导致丙型肝炎的病原体,目前治疗丙型肝炎费用昂贵,停药后复发率高。因此寻找抗HCV的新药已成为人们关注的热门课题。然而,至今HCV的细胞培养尚在研究中,且仅人和黑猩猩易感,故目前尚缺乏理想的研究或筛选抗HCV药物的体内外模型。HCV NS3蛋白酶可裂解HCV多聚蛋白的非结构蛋白区NS3-4A,NS4A-4B,NS4B-5A和NS5A-5B连接[1]。近年来,HCV NS3蛋白酶已作为抗HCV药物作用的靶酶,其相关蛋白NS4A,是NS3蛋白酶活性的辅助因子,NS4A可提高NS3蛋白酶活性[2]。Sudo等[3]以HPLC方法测定HCV蛋白酶活性,用于药物筛选,但样品需要较高纯度。为大量筛选抗HCV药物,笔者建立了HCV NS3-NS4A蛋白酶的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。

  材料和方法

  材料 质粒pMAL-c2/NS3-4A为本室制备。鼠抗NS3蛋白的单克隆抗体由中国预防医学科学院病毒所詹美云教授惠赠,辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体购自Promega公司。地高辛标记-N-羟基琥珀酯(Dig-NHS),碱性磷酸酶标记的抗Dig-NHS抗体为Boehringer mannheim公司产品。合成肽:Ac-GEA/GDD/IVP/CSM/SYT/WTK-Biotin-OH.由赛百盛公司合成。其余均为国产分析纯试剂。药物:1,4萘醌为本院校药物所王琳教授惠赠。

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析 按文献[4]的方法进行。

  HCV NS3-4A融合蛋白的制备 将重组质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,阳性菌落加入含100 μg/ml氨苄青霉素的1升LB培养液中,于37 ℃培养,当A570 nm=0.4时加1 mmol/L IPTG诱导4 h收获菌体,加裂解液(每升含20 ml 1.0 mol/L Tris.Cl,pH7.4,11.7 g NaCl,2.0 ml 0.5 mol/L EDTA,154 mg二硫苏糖醇(DTT),0.1%Triton-X 100,1 mg溶菌酶),超声波破碎,亲和层析,用含10 mmol/L麦芽糖的柱缓冲液(终浓度∶20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT)洗出融合蛋白,用Bradford蛋白实验检测蛋白含量。

  建立测定酶活性的ELISA方法 将100 μg/ml麦芽糖结合融合蛋白MBP-NS3-4A溶于缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5 mmol/L CaCl2,10 mmol/L DTT,30 mmol/L NaCl)中,与二甲基亚砜(DMSO)25 ℃预先孵育15 min,然后加入终浓度为86 μmol/L的底物,60 min后,加3倍体积DMSO终止反应。取2 μl上述反应液加入5 μl 100 mmol/L碘乙酸钠在微孔板中于37 ℃保温30~60 min,以阻断自由的半胱氨酸,然后加入50 μl DMSO溶解的2 mg/ml Dig-NHS于37 ℃保温30~60 min。加入阻断剂,室温放置60 min,加碱性磷酸酶标记的1∶1000抗Dig-NHS抗体,室温放置60 min。加对硝基苯磷酸显色15 min,测A405 nm。同时设置不加MBP-NS3-4A蛋白酶的阴性对照。以实验孔A值/阴性孔A值(P/N值)作为测定结果。

  1,4萘醌对HCV蛋白酶活性的抑制作用 用DMSO将1,4萘醌分别配成为1、0.1、0.01和0.001 mmol/L,每个浓度两孔,与HCV NS3-4A蛋白酶25 ℃预先孵育15 min,其余步骤与测定酶活性方法相同。同时设立阴性,阳性及药物对照孔。

  结  果

  HCV NS3及NS3-4A融合蛋白的诱导表达及免疫学鉴定 含重组质粒pMAL-c2/NS3或pMAL-c2/NS3-4A的菌液经IPTG诱导后,超声破碎细胞,离心,取上清两份,一份作SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后显示,IPTG诱导后在相对分子质量(Mr)为112 000和116 000处有NS3及NS3-4A蛋白带出现(附图A)。另一份经亲和层析纯化后,作Western blot免疫印迹鉴定,目的蛋白带与抗NS3蛋白的单克隆抗体发生阳性反应(附图B)。

  HCV NS3-4A融合蛋白酶活性ELISA测定的最佳条件 蛋白酶浓度为2.5、0.5、0.1 mg/ml,Dig-NHS浓度为2、0.8、0.32 mg/ml,抗Dig抗体浓度为1∶250、1∶500、1∶1000,按L9(34)正交表进行ELISA试验。结果显示,当蛋白酶反应温度为37 ℃时,最佳试验条件为:0.5 mg/ml蛋白酶,2 mg/ml Dig-NHS,1∶500抗Dig抗体,其P/N值为3.50。当蛋白酶反应温度为25 ℃时,最佳试验条件为:0.1 mg/ml蛋白酶,2 mg/ml Dig-NHS,1∶1000抗Dig抗体,其P/N值为3.63。

  ELISA测定方法的重复性评价 采用蛋白酶反应温度为25 ℃时的最佳条件进行重复性试验,同批试验中重复10次,平均P/N值为3.652,批内变异系数为4.16%;不同的10批重复试验,平均P/N值为3.632,批间变异系数为7.52%。

  1,4萘醌对HCV蛋白酶活性的抑制作用 随1,4萘醌浓度增高(0.001、0.01、0.1和1 mmol/L),对蛋白酶的抑制作用也随之增大,抑制率分别为18.60%、64.20%、72.48%、90.80%,其对蛋白酶活性抑制率达50%时的药物浓度(IC50)为8.36 μmol/L。

附图 HCVNS3/NS3-4A基因在大肠杆菌中的表达及Western blot检测

  fig  HCVNS3/NS3-4A expression in E.coli and Western blot analysis

  a.SDS-PAGE Lane M:protein markers;Lane 1,2,3,4:uninduced samples containing pMAL-C2/NS3,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2;Lane 1,2,3,4’:IPTG-induced samples containing pMAL-C2/NS3,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2/NS3-4A,pMAL-C2

  b.Western immuno-blot 1.MBP-NS3;2.MBP-NS3-4A

  讨  论

  HCV丝氨酸蛋白酶NS3是丙型肝炎病毒繁殖必不可少的复制酶,因此它可作为抗HCV药物靶点。NS4A可提高NS3裂解活性,虽然裂解NS5A-5B连接NS4A不是必需的,但Sudo等[3]试验发现合成多肽底物时,NS3-4A裂解活性比单独用NS3活性更强。

  Sudo等[3]曾报道用HPLC方法检测HCV蛋白酶裂解底物活性,并以此方法筛选抑制剂,但此方法要求抑制剂的纯度高,且不利于大量筛选。Takeshita等[5]用ELISA与HPLC方法作比较,抑制剂对酶活性抑制效果类似,说明ELISA方法同样可用于抑制剂的筛选。本研究参考国外相关资料,建立了HCV蛋白酶的ELISA测定法。实验证实1,4-萘醌显著抑制HCV蛋白酶活性,与国外报道一致[5]。当严格控制试验条件,操作规范时,该方法不仅简便、快速,而且稳定、重复性好,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,因此适用于同时筛选大量样品,并可成为寻找抗HCV新药非常有效的体外实验模型。

  国家自然科学青年基金(39700180)资助

  陈湘红(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所病毒室,北京100050)

  郭巨涛(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所病毒室,北京100050)

  陈鸿珊(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所病毒室,北京100050)

  王琳(中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所病毒室,北京100050)

  参考文献

  [1]Bartenschlager R,Ahlborn-Laak,Mous J,et al.Kinetic and structural analyses of hepatitis C virus polyprotein processing.J Virol,1994,68:5045-5055

  [2]Steinkuler C,Urbani A,Tomei L,et al.Activity of purified hepatitis C virus protease NS3 on peptide substrates.J Virol,1996,70:6694-6700

  [3]Sudo K,Inoue H,Shimizu Y,et al.Establishmemt of an in vitro assay system for screening hepatitis C virus protease inhibitors using high performance liquid chromatography.Antiviral Res,1996,32:9-18

  [4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T著.金冬雁,黎孟峰等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1992.255-262,880-898

  [5]Takeshita N,Kakiuchi N,Kanazawa T,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for detecting proteolytic activity of hepatitis C virus protease.Anal Biochem,1997,247:242-246



医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《酶联免疫吸附试验检测HCVNS3-4A蛋白酶活性》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: