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血清P53-IgG抗体测定及其临床价值初步研究

来源:中华检验医学杂志 作者:谢鑫友… 2009-2-21
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摘要: 摘要目的建立血清P53蛋白IgG抗体(P53-IgG) 酶免疫测定法,初步探讨其临床价值。方法以P53MoAb为包被抗体,以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介,自行建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。结果78例消化道癌P53-IgG阳性率34。48例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56。...


摘 要 目的 建立血清P53蛋白IgG抗体(P53-IgG) 酶免疫测定法,初步探讨其临床价值。方法 以P53MoAb为包被抗体,以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介,自行建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。结果 78例消化道癌P53-IgG阳性率34.62%(27/78),而32名献血员和30例非癌住院患者均为阴性,P均<0.01。48例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%(27/48),显著高于阴性对照组(0/30),P<0.01。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%,敏感度34.62%,阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。本方法测定特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%。结论 血清P53-IgG测定与P53蛋白表达相关,是P53基因研究的新的辅助指标之一。

  关键词:血清学诊断;酶联免疫吸附测定;P53抗体

  P53抑癌基因是研究最为深入的肿瘤相关基因之一,其与肿瘤产生、肿瘤生长调控|肿瘤细胞凋亡等关系密切。P53基因表达与肿瘤浸润转移和复发潜能有关,P53基因蛋白(即P53蛋白)阳性的肿瘤预后不良。检测 p53基因/蛋白对评价患者预后和提高患者术后生存期限具重要价值。P53基因/蛋白检测以往仅限于手术切除肿瘤组织的免疫组织化学染色和DNA原位杂交。最近发现 p53基因/蛋白阳性肿瘤患者血清中存在特异性的抗P53蛋白抗体(P53-IgG),P53-IgG测定可用于肿瘤转移,复发预测和P53表达动态观察,已引起了国内外学者的关注[1,2]。本研究自行建立了P53-IgG测定方法,并探讨其临床初步应用价值,现报道如下。

  材料和方法

  一、材料

  1.试剂:CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia 公司,瑞典 ),P53 MoAb(MS-105,Clone: Pab 1801,福州迈新生物技术公司进口分装),酯化生物素(美国Sigma公司),亲和素(上海丽珠东风试剂厂),免抗人IgG酶标抗体(丹麦Dako公司)。

  2.标本来源:血清标本130份,其中献血员32份,年龄23~42岁;非癌住院患者30份(脑卒4份,肝硬化12份,高血压11份,消化性溃疡3份),年龄31~64岁;消化道癌78份(胃癌62份,肝癌11份,大肠癌5份),年龄48~78岁。以上肿瘤均经手术,病理证实。所有标本经肘静脉取血3 ml,新鲜分离血清,置-20℃保存,备用。

  二、方法

  1.P53蛋白粗制品的制备:收集数份经冰冻切片P53染色阳性胃癌组织,仔细剔除正常组织、纤维,并剪成1 mm×1 mm×1 mm,加入4倍体积的冰冷0.1 mol/L Tris 盐酸缓冲液 (内含0.1%苯磺酰氯,1.0% triton-100)高速匀桨,4℃搅拌过夜,次日再超声粉碎(0℃15 s×8次),10 000 r/min离心15 min,弃沉淀,上清液经生理盐水透析平衡[3]。另取预经对0.1 mol/L NaHCO3透析平衡的P53 MoAb 1 ml与1gCNBr-Sepharose 4B按说明书交联,即为亲和层析柱,将上述肿瘤上清液流穿此柱,经解吸后即可获P53粗制品。加0.1%NaN3置2~8℃保存。

  2.P53 MoAb与酯化生物素交联:同文献报道[4]。制备生物素化P53 moAb置30%甘油2~8℃保存。

  3.血清P53-IgG测定:将亲和素以10 mg/L浓度包被微孔,4℃过夜,次日取出洗涤3次后,用10%小牛血清37℃封闭30 min,洗涤2次,加入生物素化MoAb 50 μl和50 μl预经反应 4℃过夜的血清-P53粗制品混合液(血清1∶50,P53粗制品1∶25,等量混匀),混匀1 min,37℃反应60 min,洗涤3~5次,加入免抗人IgG酶标抗体,37℃反应60 min,洗涤3~5次,加四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)底物避光显色10~15 min,以50 μl/孔2 mol/L盐酸终止反应,以490 nm测各孔A值。同时设立阴性及空白对照。阳性判断标准:凡大于献血员平均吸光度X+2.56s以上者为阳性。

  4.方法学质控:同一样本同次重复20孔,计算批内差异,同一样本不同批次连续检测10次,计算批间差异。

  三、统计方法

  采用卡方检验

  结果

  1.从近20 g肿瘤组织中用亲和层析法分离P53粗制品420 mg,用Western-Blot法鉴定内含数种杂蛋白,与P53 MoAb呈强反应。

  2.不同疾患血清P53-IgG阳性率测定结果表明献血员、非癌住院患者均无P53-IgG表达(0/32,0/30),消化道肿患者P53-IgG阳性率34.62%(27/78),显著高于前两组,P值均<0.01。血清P53-IgG测定的特异性100%,敏感性为34.62%。

  3.免疫组化染色P53阳性患者血清P53-IgG测定结果示30例P53阴性患者P53-IgG均阴性,而48例P53阳性患者P53-IgG阳性率56.25%,二者差异有显著意义,P<0.01。提示P53-IgG表达与P53基因/蛋白表达密切相关。血清P53-IgG测定的阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。

  4.5例P53-IgG阳性患者在肿瘤切除后15 d,30 d测定仍为阳性,6~12月后复查P53-IgG均为阴性。提示P53-IgG水平随肿切除缓慢下降,速度较慢可能与IgG半衰期长有关。

  5.本方法测定的特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%。

  讨论

  P53抑癌基因分野生型和突变型2种。野生型存在于正常体细胞内,对细胞的生长、分化起调控作用,含量甚微,用现行技术不能检测到野生型蛋白;突变型P53基因由于其DNA碱基突变(多为点突变),致合成的P53蛋白构象改变,正常生理功能丧失或减弱,并致P53蛋白在细胞核内异常堆积,易被现行技术检测到,业已证明这种异常的P53蛋白多表达于肿瘤细胞内,其表达是否与肿瘤预后有关[5]。Crawford等[1]发现突变型P53蛋白随肿瘤细胞的死亡崩解而释放入血,刺激机体免疫系统产生特异性的自身抗体。Trivers等[2]认为测定血清P53-IGG对预测肿瘤浸润转移和复发有重要价值。与传统的免疫组化染色法相比较,血清P53-IgG测定取材更方便,更有利于术后复发监测及P53动态观察。

  我们在国内率先建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。采用进口P53 moAB作为第一抗体(包被抗体)避免了结果的假阳性、假阴性反应,保证方法的高特异性;采用亲和素-生物素技术可提高方法检测灵敏度。结果显示,本法检测特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%,具较高灵敏度。我们在试验中发现直接采用P53蛋白粗制品包被微孔时,其检测灵敏度低,P53蛋白粗制品用量大。遂设计了先将样本血清与P53蛋白粗制品反应,形成抗原抗体复合物,然后再分别与P53 moAb、免抗人IgG酶标抗体反应,则避免了P53蛋白粗制品直接包被时的不足。

  本试验结果表明,献血员和非癌住院患者血清P53-IgG均阴性,78份消化道肿瘤其阳性率为34.62%,48份经免疫组化染色P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%,敏感性34.62%,阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。提示P53-IgG与P53蛋白表达相关。然也有部分P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阴性。因而P53-IgG阴性不能排除P53蛋白阳性可能,其原因可能与机体荷瘤大小、时间等有关,尚需作进一步探讨。另作者观察了P53-IgG阳性患者手术后的P53-IgG动态变化,发现术后15 d、30 d P53-IgG仍阳性,但术后6~12月则转为阴性。

  作者单位:谢鑫友(310016杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  姜红英(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  林洁(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  费春荣(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  参考文献

  1,Crawford LV,Pim DC,Bulbrook rD.Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer, 1982, 30:403-408.

  2,Trivers GE, Cawley HL, DeBenedtti VM,et al.Anti-p53 antibodies in sera of workers occupationally exposed to vinyl chloride. J Natl Cancer inst,1995,87:1400-1407.

  3,朱永良,钱可大,唐训球,等,抗胃癌细胞单克隆抗体的制备.浙江医科大学学报,1996,25:21-23.

  4,洪孝庄,孙曼雯,主编.蛋白质连接技术.北京:中国医药科技出版社. 1993. 35-37.

  5,Mudenda B, Green JA, Green B, et al. The relationship between serum P53 autoantibodies and characteristecs of human breast cancer. Br J Cancer, 1994,6:1115-1119.



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