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国内外标记免疫分析技术研究现状

来源:检验医学网络杂志 作者:李振甲 2009-2-21
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摘要: 摘要: gin=0 topMargin=0标记免疫分析是一大类超灵敏度,高特异性检测技术的总称,因其具有许多独特优点,已广泛应用于基础医学和临床各领域。它们的基本原理相同,仅依标记物的不同而最终测量所发出的信号而异。虽然文献报告的方法已有10余种,但有推广应用价值或已被广泛应用的主要有:放射免疫分析(RIA)、酶免疫分......


摘要: gin=0 topMargin=0>  标记免疫分析是一大类超灵敏度,高特异性检测技术的总称,因其具有许多独特优点,已广泛应用于基础医学和临床各领域。它们的基本原理相同,仅依标记物的不同而最终测量所发出的信号而异。虽然文献报告的方法已有10余种,但有推广应用价值或已被广泛应用的主要有:放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和化学发光免疫分析(CLIA)等。以下仅就这四种分析技术研究现状和前景作简要介绍。

  放射免疫分析

  一、试管固相法[1]

  当前RIA发展的方向是以试管固相作为取代常规液相法的换代技术。试管固相法在抗原、抗体免疫反应完成后不必加分离剂和低温离心程序,只需测量管的放射性便可得出待测物浓度,操作简便快速,适合大量临床样品的检测。尤其以洗涤代替分离和离心,降低了非特异性结合,提高了方法精密度和准确性。

  固相抗原或抗体的包被,常规物理吸附法,所包被蛋白质的量小,均一性差,仅适合双位点夹心法。1990年Causse等[2]提出以顺丁烯二酸酐-苯乙烯共聚体处理聚苯乙烯管进行活化,以共价键结合包被,提高了包被的牢固性、均一性和蛋白质的量。但因工艺流程复杂,难以推广。我们在实验研究中发现,向试管内加一种双功能基团偶联剂处理试管,类似共价键结合包被,获得满意结果。最近国外厂家已研制出氨基活化和琥珀酰亚胺酯活化,以共价键取代物理吸附,从根本上解决了固相抗体或抗原的质量问题,完全满足不同反应模式的要求。

  试管固相RIA,其反应模式也相应地进行了改进,目前应用的有下列数种。

  1.固相二抗竞争法:此模式是将二抗制成固相管作为通用分离技术,应用范围广。测定时将125I标记抗原,待测样品和稀释第一抗体加至二抗固相管中温育,洗涤后测量放射性。

  2.亲和素固相竞争法 :将亲和素包被制成固相管,取第一抗体生物素化。测定时取125I标记抗原,生物素化抗体和待测样品加至固相亲和素管中温育,洗涤后测放射性。此固相管不仅可以通用,且灵敏度有所提高。

  3.固相抗原竞争法[3]:本法是一种新型反应模式,适用甾体类、环核苷酸和药物等小分子化合物的检测。先将小分子半抗原经偶联剂和牛血清白蛋白结合包被试管,制成固相半抗原,经无水乙醇固定可长期保存。测定时将样品和125I标记抗体加至固相半抗原管中温育,固相半抗原和待测物共同竞争性地与125I标记抗体结合,洗涤后测管的放射性。

  4.固相抗体竞争法: 将抗体IgG包被制成固相抗体。测定时,将样品和125I标记抗原加至固相抗体中温育,洗涤后测管的放射性。

  二、多肽类双抗体夹心法[4]

  利用肽类分子片段抗体建立试管固相双抗体夹心法,是多肽RIA技术一大进展,提高了方法的灵敏度和特异性。例如促肾上腺皮质激素目前合成的片段已有16个,取1~13片段和18~39片段分别和蛋白结合,分别免疫兔和山羊,制备2个片段的抗体。将1~13片段抗体包被试管制成固相抗体,另将18~39片段抗体进行125I标记。测定时将样品和125I标记抗体加至固相抗体管中温育,洗涤后测放射性。本模式简便易行,更重要的是适于抗原分子上无可供125I标记的基团的一类物质。

  三、多肽或小分子蛋白片段抗体的应用

  最近的研究结果表明,利用多肽或小分子蛋白质片段和牛甲状腺球蛋白结合制备的片段抗体,可以和完整的多肽或小分子蛋白产生免疫反应,并且和125I标记的片段呈现竞争性结合反应。这一发现为应用片段抗体,建立RIA测定生物样品中活性物质提供了理论依据。例如骨钙素(BGP)是一种分子量为6 000的小分子蛋白质,国外建立RIA采用从动物骨组织提取抗原[5]。我们将BGP分子上人工合成的9~17氨基酸片段(Sigma产品)制备的抗体,建立了BGP RIA方法,各项技术指标达到国外同等水平。

  四、提高分析方法灵敏度的新途径

  目前发现,在生物材料中含量很低的一些活性物质,却具有重要的生物学效应,常规RIA方法难以测出。采用冻干方法不便推广,我们在实践中证实以下两种间接提高灵敏度的方法较为实用。(1)碳18硅烷微柱提取法:取血浆4 ml加0.1%三氟乙酸10 ml,混匀后放置10分钟,离心3 500 r/min,15分钟,取上清液加至预先洗涤过的微柱中。然后用蒸馏水淋洗,再向柱中加75%甲醇(含0.1%三氟乙酸)3 ml淋洗,流出液收集至10 ml青霉素瓶中,电扇吹干,置-20℃保存, 测定前加0.4 mlPBS溶解。此时样品已浓缩10倍。(2)试管固相抗体捕获法:将抗体IgG稀释,取1 ml加至试管中包被,制成固相试管。取待测样品1 ml加至固相抗体管中,置37℃3~5小时,将样品吸出弃去,向管内加125I标记抗原,再次放37℃ 3~5小时,洗涤后测管的放射性。

  酶免疫分析

  EIA是在RIA基本理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。早期只有一种反应模式,只限于病原微生物抗原或抗体的快速定性测定。因标记物制备简易,有效期长和不污染环境等优点,加速了对EIA技术的研究和应用,方法日臻完善,其灵敏度和应用范围均已达到RIA的同等水平。

  一、固相抗体制备新工艺[6]

  1993年Yonezawa应用氨基化酶标板以共价键结合代替物理吸咐包被抗体,将包被的均一性、牢固性和控制包被抗体IgG的量提高到一个新水平,并建立了甾体激素的竞争性EIA,获得满意结果。最近美国康宁公司研制成功表面经琥珀酰亚胺酯活化酶标板,其质量达到氨基活化相似水平。由于抗体包被技术的改进,EIA的应用发展甚速。

  二、增强发光酶免疫分析[7]

  增强发光酶免疫分析(enhaned luminescene enzyme immunoassay,ELEIA)是EIA技术的新发展。其特点是酶促增强发光信号,并稳定和延长发光信号时间。既保持发光免疫分析的高灵敏度,又克服了传统发光酶免疫分析所发信号时间短的缺点,目前国外已实现自动化分析。

  1.辣根过氧化物酶(HRP)-ELEIA:以第二抗体包被活化酶标板,将HRP和抗原结合。测定时将样品、酶标抗原和第一抗体加至二抗板孔中温育,洗涤后向孔内加发光底物(liminol-H2O2和对碘酚液),即刻发出光信号,并可持续半小时,最小检出值可达10-17 mol/孔。

  2. 碱性磷酸酶-ELEIA : 研究结果显示,二氧环乙烷的衍生物在适宜的缓冲液中经碱性磷酸酶的催化可发出强度很高的光信号。根据这一特征,以碱性磷酸酶标记抗体建立夹心型EIA,最小检出值可达10-20 mol/孔。目前常用的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-(3-磷氧酰)-苯基1,2二氧环乙烷(简称AMPPD)液。

  三、生物活性多肽双位点夹心发光EIA

  1996年Iwata等报告一种夹心型血浆内皮素(EI-1) 发光酶免疫分析。以兔抗EI-1 15~21片段抗体包被酶标板,另取抗ET-1 fab′标记HRP。发光底物为Luminol-H2O2 4-[-4′-(2-甲基-噻唑)酚]。测定时,将样品和酶标抗体加至固相抗体孔中温育,洗涤后加发光底物。本法最小检出值为0.05 pg/孔。

  四、 提高测定半抗原灵敏度的新模式

  为了测定生物样品中浓度很低的化合物,国外作者设计了一种新模式,即将待测抗原连接一个多肽,然后进行生物素化,可以得到一个半抗原结合多个生物素分子。以SA-HRP作示踪物,建立固相抗体竞争法。国外有的试剂盒已采用了这一技术。

  五、 双特异性单克隆抗体(McAb)双位点夹心法[7]

  双特异性McAb是指1个McAb分子IgG可以特异性地结合1个抗原和1个酶分子。利用双特异性McAb可建立不必进行抗体酶标的分析技术,操作简便,灵敏度和特异性高,是一种有发展前景的方法。其不足之处是制备这种抗体比较复杂。目前尚处于实验室研究阶段。

  时间分辨荧光免疫分析

  时间分辨荧光免疫分析 (time-resolved fluorimm-unoassay, TRFIA)是80年代初问世的另一种非放射性免疫分析法,其主要特点是示踪物为标记稀土元素,如Eu3+、Tb3+或Sm3+。稀土离子最大的特征是具有较大的Stokes移位,即激发光波长337 nm,发射波长615 nm,两者相距290 nm,测量发光信号不受发射光信号的干扰,并且完全排除自然界一般荧光(一般荧光Stokes移位28 nm)的干扰。TRFIA问世仅10多年的历史,由于技术上的独特优势,如灵敏度可达10-17 mol/孔,应用范围广,从而其试剂盒的生产和测量仪的更新换代进展甚速,目前已实现分析技术完全自动化。有关这方面的理论和临床应用已有专著出版[8]。以下简述最新进展。

  1.通用Eu3+标记化合物:将链霉亲和素-生物素系统用于TRFIA已十分完善,适用于各种免疫反应模式。1993年重组蛋白G已商品化。蛋白G保留了与Fc端IgG结合的特性,并且带有13个赖氨酸,是标记高比活性Eu3+的理想物质,不仅可以通用,还可以进一步提高它的灵敏度,但缺点是样品不得含有蛋白质,可用于脂溶性半抗原的测定。

  2.提高半抗原标记率方法的新进展:提高半抗原标记率的目的,是将方法的灵敏度提高到一个新水平,以适应生物样品中浓度很低的物质的测定。文献报告已研究出2种方法,其一是将半抗原和聚赖氨酸结合作为标记Eu3+的前体,另一种是将链亲和素与甲状腺素球蛋白结合作为标记Eu3+的前体。利用这两种人工合成的标记前体制备的Eu3+标记物,将方法的灵敏度提高了1~2个数量级。

  化学发光免疫分析

  1978年Schrpeder在RIA和EIA基本理论的基础上,以化学发光信号示踪,建立了化学发光免疫分析(CLIA)技术。因其具有和RIA相似的灵敏度和特异性,受到国内外学者的重视,并投入了相当的人力和资金对方法进行研究,并制造测量仪器。大量的实验结果证明,CLIA因光信号持续时间太短,达不到临床应用水平。为解决方法学上的自身缺点,一些学者进行了发光稳定剂的研究,90年代初首先由英国Amersham公司研究人员发现在HRP催化Luminol发光反应中加微量对-碘酚,可以使发光信号持续20~30分钟。随后生产出试剂盒。

  最近的研究结果证明,以甲基吖啶酯标记抗体是较理想的发光物质。因其不必加催化剂,受外界干扰因素少,只需在碱性溶液中加入微量H2O2,就可发出很强的光信号。此外,吖啶酯作为标记物操作简易,稳定性高,自然本底很低,标记蛋白后不降低发光信号的产生。这些因素是提高灵敏度的有利条件,最小检出值可达10-18 g/ml。

  目前美国Ciba Cornig公司研制了ACS-180 CLIA自动免疫分析系统,并提供为仪器相匹配的吖啶酯标记免疫试剂盒。由一台仪器完成全部检测程序。

  Yalow和Berson创建RIA技术是生物医学检验发展史上的重大突破。在RIA理论的基础上相继派生出许多非放射性标记免疫分析技术。近年来,非放射性标记免疫分析技术发展迅速。RIA使用放射性核素,污染环境,有效期短,测量时间长等自身缺点难以实现自动化,限制了进一步发展。目前TRFIA和CLIA已实现了自动化。从现状来看非放射性取代RIA只是时间问题。关于TRFIA和CLIA两大自动化分析系统,在推广应用方面吖啶酯CLIA分析系统似乎处于优势。

  作者单位:100853 解放军总医院基础医学研究所参考文献

  [1] 李振甲,陈素娟,王录焕,等.试管固相RIA和IRMA技术的实验研究.中国免疫学杂志,1993,3:223-225.

  [2] Causse E, Ricorde I, Bacheier MN, et al. Radioimmu nologcal determintion of total thyroxin by antbodies immobilized on polystyrent tubes Coated with Styrene-maleic anhydrid Copolymers. Clin Chem, 1990,36:525-528.

  [3] 李振甲,高平.标记免疫检验技术研究的新进展.中华医学检验杂志,1994,17:308-310.

  [4] Towbin H, Motz J, Oroszlan P, et al. Sandwich immunoassay for hapten angiotensin Ⅱ. J Immunol Methods, 1995,181:167-176.

  [5] Pastoureau P, Delmas PD. Measurement BGP in humans with an ovine BGP-Based radioimmunoassay. Clin chem, 1990,36:1620-1622.

  [6] Yonezawa S. Covalent couping of steroid to microwell plates for use in Competitive enzyme-linked immuosorbent assay. J Immunol Methods. 1993, 166:55-61.

  [7] 李振甲,酶免疫分析技术研究进展.标记免疫分析与临床,1998,5:215-219.

  [8] 李振甲,陈泮藻,高平,等.时间分辨荧光分析技术及应用.北京:科学出版社,1996.16-20.



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