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重组抗原检测抗干燥综合征A抗原的自身抗体

来源:中华医学检验杂志 作者:邓安梅… 2009-2-21
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摘要: 【摘要】目的建立便捷的检测抗干燥综合征(SS)A抗原(分子量为60 000的多肽成分)的自身抗体(抗SSA)的方法,以利于疾病的早期诊断和病程监控。经GST柱层析法纯化后,分别经免疫印迹(IBT)法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测20份SS患者血清、60份系统性红斑狼疮(SLE)患者血清和30份正常人血清。结果利用重组抗原检测抗SSA自身抗体......


【摘要】目的 建立便捷的检测抗干燥综合征(SS)A抗原(分子量为60 000的多肽成分)的自身抗体(抗SSA)的方法,以利于疾病的早期诊断和病程监控。方法 构建基因工程菌,表达SSA-60 000融合蛋白。经GST柱层析法纯化后,分别经免疫印迹(IBT)法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测20份SS患者血清、60份系统性红斑狼疮(SLE)患者血清和30份正常人血清。结果 利用重组抗原检测抗SSA自身抗体敏感性较高,而且抗体滴度与SLE病程相关。用IBT法,SLE和SS患者的阳性率分别为43.3%和10%;用ELISA法,SLE和SS患者的阳性率分别为50%和25%。结论 利用重组抗原对自身抗体进行定性、定量分析有助于对自身免疫病的诊断和监控。

Recombinant antigen for detecting anti-SSA autoantibody

DENG Anmei, ZHONG Renqian, CHEN Sunxiao, et al.

  Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003, China

   【Abstract】Objective To detect the level of anti-SSA-60 000 autoantibody in patients with autoimmune diseases as well as its assay methods.Methods We cloned Ro-60 000/SSA cDNA and expressed the SSA-60 000-GST fusion proteins in E.coli JM109. Purified recombinant antigens were used in immunoblotting test (IBT) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were developed. 20 SS sera, 60 SLE sera, 30 normal control sera were tested.Results The recombinant antigen improved the sensitivity for detecting anti-SSA-60 000 autoantibody. Longitudinal studies of several patients with SLE showed that the titres of anti-SSA-60 000 autoantibody were related to the course of disease.Conclusion Recombinant autoantigen is useful for analysis of auotantibody to diagnose and control diseases.

   【Key words】Autoimmune diseases;Autoantibodies;Recombinant proteins; Enzyme-linked immunosorbent assay

  在系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等自身免疫性疾病中,干燥综合征A抗原(SSA)是重要的自身抗原[1]。在约70%~80%的SS患者和30%~40%的SLE患者存在抗SSA抗体。SSA抗原多肽包括60 000和52 000两种分子量不同的成分。传统上用于检测抗体的SSA抗原从动物组织中提取,制备较复杂,且来源不同,成分有所差异。因此,我们尝试用重组抗原检测抗SSA-60 000自身抗体(抗SSA-60 000),建立敏感性和特异性良好的检测方法,以利于疾病的早期诊断和病程监控。

  材料和方法

  一、材料

  1.人肝λgt11 cDNA文库(R.W.Davis博士赠送);PGEX-2T质粒,JM109菌株(Z R Lian博士赠送)

  2.标准抗SSA-60 000阳性血清由美国疾病控制中心提供。患者血清来自本院1994年8月至1997年8月收治的住院患者,其中SLE 60例、SS 20例。所有患者均符合美国风湿病学会制定的诊断标准[2,3]。30份正常对照血清取自献血者。常规检查采用德国的间接免疫荧光试剂盒及国内IBT检测试剂盒。

  二、方法

  1.SSA-60 000抗原的基因克隆与序列测定:以标准抗SSA-60 000血清为免疫探针,采用噬斑原位印迹法,筛选人肝λgt11 cDNA文库,挑取表达SSA-60 000融合蛋白的阳性克隆。通过DNA测序鉴定SSA-60 000 cDNA[4]

  2.构建表达型SSA-60 000重组菌:经PCR扩增,将SSA-60 000 cDNA经BamHI和EcoRI双酶切后定向插入PGEX-2T质粒,经CaCl2法转导入宿主菌JM109,再经双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。

  3.SSA-60 000重组融合蛋白的表达,鉴定与纯化:挑取重组克隆于37℃振摇培养, 加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导2小时。收集菌液,经谷胱苷肽亲合层析柱纯化,收集洗脱液,进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),经免疫印迹法(IBT)分析重组融合蛋白的抗原特异性。

  4.重组融合抗原ELISA法测自身抗体:重组融合抗原用包被碳酸氢钠缓冲液(pH9.5)调节至4 mg/L,加入微量滴孔中,4℃过夜(16 h)。而后依序加入被检血清、辣根过氧化物酶羊抗人IgG、显色剂3,3-二氨基联苯胺和H2O2,经酶比色仪450 nm比色。设相应的血清稀释液抗原抗体反应产物在450 nm产生的1个吸光度A数字为抗体1个单位(U)。

  5.统计学处理:用Student′s t检验分析均值差异。

  结果

  1.重组质粒的鉴定:重组质粒经EcoRⅠ和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳显示,在约为1.6 kb处可见清晰的特异性扩增条带,证实质粒载体中含有以正确方向插入、符合预期长度的目的基因(图1)。DNA测序表明它是SSA-60 000基因的精确拷贝。

 1:DNA标准;2:SSA抗原PGEX-2T重组子经EcoRI和BamHI双酶切后;3:载体PGEX-2T质粒;4:分子量为60 000的干燥综合征A抗原PCR产物

1 干燥综合征A抗原(SSA)PGEX-2T重组质粒PCR电泳图

  2.SSA-60 000重组GST融合蛋白的表达、纯化:经IPTG诱导表达的大肠埃希菌菌液经10%SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,在约84 000处有一浓染蛋白条带,而未经IPTG诱导的菌体蛋白在此处呈阴性。经谷胱苷肽层析柱纯化细菌培养液后,获得纯化的融合蛋白(图2)。

 1:标准蛋白质;2:含空载体PGEX-2T质粒的JM109菌裂解液;3:含重组子SSA PGEX-2T的JM109菌裂解液;4:纯化的SSA-GST融合蛋白

2 重组融合蛋白电泳图

  3.用重组融合抗原检测抗血清:经不同标准抗血清IBT反应证明,重组抗原能与标准抗SSA血清反应,与其他抗血清(如抗La抗体)无交叉反应。可能由于选取抗原来源以及制备过程的差异,我们常规检测所用的IBT检测试剂盒几乎检测不出抗SSA抗体。而用重组融合抗原经IBT和ELISA法却能弥补此不足。用重组融合抗原SSA经IBT检测,30份献血员的血清均为阴性。而在SLE患者中有26例(43.3%)抗体阳性,SS患者中有2例(10%)抗体阳性。在ELISA法检测时,正常对照组值为100 U±50 U,因此以大于350 U(

  在ELISA法检测中,分别加入标准抗SSA-52 000、抗SSB、抗平滑肌抗体、抗U1 核糖核蛋白血清,反应均为阴性,表明此重组抗原ELISA法检测抗SSA-60 000抗体具有特异性。我们将同一份血清标本检测10次,所得结果的变异系数(CV)值为0.068;将同一份血清标本分装冻存在3个月内检测10次,所得结果的CV值为10.6%,表明本研究建立的重组抗原ELISA检测法重复性和精确性较好。

  4.抗SSA-60 000抗体与疾病的关系:在SLE、SS患者中,抗SSA抗体的类型分布有所不同,抗SSA-60 000抗体在SLE阳性率为33.3%,SS为5%;而抗SSA-52 000抗体在SS阳性率为60%,SLE为20%。

  我们对4例SLE患者经雷公藤和泼尼松治疗(雷公藤3片,3次/d;强的松10 mg,3次/d)3周前后的抗体进行了ELISA检测。结果显示,治疗后症状缓解的患者中抗SSA抗体滴度下降,而无缓解的患者中抗体滴度无明显改变。

表1 SLE患者治疗前后ELISA检测抗SSA-60 000变化(U)

病例 治疗前 治疗后 t值 P值
1

998

521

3.896 <0.05
2 1080 542 4.021 <0.05
3 1246 604 3.964 <0.05
4 2498 2312 1.476 >0.05

  讨论  我们采用标准抗SSA-60 000血清筛选人肝λgt11噬菌体cDNA文库,分离表达相应抗原的克隆,对所得克隆的DNA序列进行了测定;将自身抗原目的基因克隆到表达载体上,利用工程菌表达自身抗原,经纯化后建立敏感性和特异性良好的检测方法,用于检测抗SSA抗体,以利于疾病的早期诊断和病程监控。

  本研究中含重组质粒的大肠埃希菌JM109经IPTG诱导,其裂解液经SDS-PAGE电泳在近84 000处出现大量蛋白表达,不含目的基因的大肠埃希菌JM109在相应的位置未见浓蛋白条带,而含空载体PGEX-2T质粒的大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后也出现大量蛋白表达,但位置在26 000处,这与载体表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。根据氨基酸组成推算,SSA-60 000重组蛋白的分子量为57 500,再加上载体PGEX-2T质粒本身可表达的原核多肽谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为26 000,融合蛋白分子量预计在83 500左右,我们的结果与之相符。经IBT和ELISA证实,本研究获得的重组蛋白可用于检测自身抗体。

  研究表明,抗SSA的抗体在自身免疫病临床表现中有重要意义[5]。在SS中,抗SSA抗体与脉管炎、紫癜、淋巴结病、白细胞减少和高γ球蛋白血症等临床症状呈正相关。我们对4例SLE患者经雷公藤和泼尼松治疗前后的抗体进行了ELISA检测,结果显示,治疗后症状缓解的患者中抗体滴度下降,而无缓解的患者中抗体滴度无明显改变,表明抗SSA-60 000抗体活性与临床病情呈正相关。我们以前对于自身免疫病患者中,可抽提核抗原条带与体液免疫激活状态的研究发现,自身免疫病患者中,可抽提核抗原条带越多,体液免疫激活程度越高,IgG水平越高[6]。而现在利用重组抗原检测的结果与之相一致。

  目前IBT法检测SSA-60 000敏感性不足,采用重组抗原可弥补这一缺陷, ELISA法具有定量的作用,所以可对患者病程进行监测, 但其准确界限对提高敏感性而又不降低特异性很重要,需我们在以后的工作中摸索确定。

  基金项目:上海市启明星基金资助项目(94QB14002)

参考文献

  1 Reichlin M. Autoantibodies to the RoRNP particles. Clin Exp Immunol, 1995, 99:7-9.

  2 Fox RI, Saito I. Criteria for diagnosis of sjogren′s syndrome. Rheum Dis Clin North Am, 1994,20:391-407.

  3 Tan EM. 1982 Revised criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982,25:1271-1273.

  4 邓安梅,仲人前,孔宪涛.自身抗原Ro-60 000 cDNA克隆及表达.第二军医大学学报,1998,19:20-22.

  5 邓安梅,仲人前,孔宪涛.SSA抗原研究进展及临床应用.中国免疫学杂志,1997,13:92-94.

  6 Deng AM, Zhong RQ, Kong XT. Anti-ENA profile and humoral immune activation. J Milit Med Univers, 1999,20:38-44.



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