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狼疮性BXSB小鼠抗DNA抗体水平的动态变化

来源:免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 狼疮性BXSB小鼠抗DNA抗体水平的动态变化 免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学 作者:徐志伟邓鸿业邓玉兰丁桂凤 单位:徐志伟(北京医科大学免疫学系,北京100083)。 丁桂凤(北京医科大学免疫学系,北京100083) 关键词:狼疮性小鼠。抗DNA抗体。尿蛋白质 摘要:目的探讨系统性红斑狼疮性小鼠抗DNA抗体......


狼疮性BXSB小鼠抗DNA抗体水平的动态变化

免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学

作者:徐志伟 邓鸿业 邓玉兰 丁桂凤

单位:徐志伟(北京医科大学免疫学系,北京 100083); 邓鸿业(北京医科大学免疫学系,北京 100083); 邓玉兰(北京医科大学免疫学系,北京 100083); 丁桂凤(北京医科大学免疫学系,北京 100083)

关键词:狼疮性小鼠;抗DNA抗体;血尿素氮;尿蛋白质

  摘 要:目的 探讨系统性红斑狼疮性小鼠抗DNA抗体水平的动态变化与疾病严重程度之间的关系。方法 测定了不同月龄的狼疮性BXSB小鼠的各种抗DNA抗体,血尿素氮和尿蛋白质浓度。结果 BXSB小鼠抗DNA抗体量的动态变化无规律性,但血尿素氮和尿蛋白质的浓度随鼠龄的增加而逐步升高。结论 抗DNA抗体水平并不与BXSB小鼠疾病的严重程度相平行,提示在诊断SLE或判断其严重程度时应测定多项实验指标为宜。

  中图分类号:R392.12 文献标识码A

Kinetics of anti-DNA antibody appearance

  in lupus-prone BXSB mice

XU Zhi-wei DENG Hong-ye DENG Yu-lan DING Gui-feng

  (Department of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)

  Abstract:Objective It remains unknown whether there is a correlation between the level of anti-DNA antibodies and pathological severity in SLE mice.Methods Anti-DNA IgG and IgM antibodies, blood BUN and urine protein in lupus-prone BXSB mice with age varying from 1 to 6 month were detected quantitatively in our experiment.Results We found that anti-DNA antibodies in serum varied irregularly while the concentration of blood BUN and urine protein increased gradually with age.Conclusion That the level of anti-DNA antibodies do not parallel the pathological severity in BXSB mice and it be necessary to survey multiple different items for diagnosing SLE or determining its seriousness.

  Key words:lupus-prone mouse; anti-DNA antibody; blood BUN;urine protein▲

  系统性红斑狼疮(SLE)是典型的自身免疫复合性疾病。患者的血清中含有多种自身抗体,一般认为抗双链DNA(dsDNA)抗体是SLE的特异性标志[1]。但是,小鼠SLE发病过程中抗DNA抗体水平的动态变化与疾病严重程度的关系还缺乏系统的研究。我们以SLE模型之一的BXSB小鼠为对象,测定了1~6月龄雌鼠和雄鼠血清中IgM和IgG类型的抗dsDNA抗体和抗单链DNA(ssDNA)抗体的水平,同时测定血尿素氮和尿蛋白质的浓度,以探讨抗DNA抗体量的动态变化与肾病变之间的关系。

  1 材料与方法

  1.1 实验动物 BXSB小鼠由北医大三院陈学荣教授自美国JACKSON实验室引进,本室饲养繁殖。

  1.2 主要试剂 小牛胸腺DNA(CTDNA),华美公司;S1核酸酶,Promega公司;生物素化羊抗小鼠IgG、IgM,Sigma公司;碱性磷酸酶标记的链霉亲合素,Vector公司;酶标板,NUNC公司;2500型酶标仪,BIORAD公司。

  1.3 抗DNA抗体的测定

  1.3.1 DNA抗原的预处理:CTDNA经酚∶氯仿∶异丙醇纯化,乙醇沉淀[2]。沉淀的DNA溶于含1mmol ZnCl2,0.06mol NaCl,0.1mol乙酸钠,pH5.0的溶液中,加S1核酸酶(100U/mgDNA),37°C作用45min,水解单链DNA。加入终浓度10mmol的EDTA-Na2终止反应[3],同上法提纯沉淀的DNA即为dsDNA。将纯化的DNA煮沸15min,迅速放冰浴中冷却变性,即得ssDNA。

  1.3.2 ELISA法测定抗DNA抗体:用PBS将dsDNA和ssDNA配成50μg/ml浓度,加在新的96孔酶标板上,每孔0.2ml,室温下过夜。弃去孔内液体,加0.25ml含10%NBS的Hepes-NaCl(Hepes0.01mol,NaC1 0.14mol,pH7.4)液,37°C封闭1h。用含0.05%Tween 20的Hepes-NaCl液洗涤(下同)。每孔加1∶50稀释的小鼠血清0.2ml,37°C作用1h(下同),洗涤。每孔加1∶2 000稀释的生物素化羊抗小鼠IgG和IgM液0.2ml。然后,每孔加1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲合素液0.2ml。最后加硝基苯磷酸钠(NPP)底物液0.2ml,显色。用酶标仪在405nm波长处读取光密度值(A405nm)。对照孔不加DNA,加1∶50稀释的正常C57小鼠血清,其余过程同上,用于校正零点。

  1.3 血清尿素氮(BUN)浓度的测定 BUN测定试剂盒购自北京北化精细化学品公司临床诊断试剂分厂。测定方法按说明书进行。

  1.4 尿蛋白质浓度的测定 按照文献[4]介绍的考马斯亮蓝法进行。

  2 结果

  2.1 抗dsDNA抗体水平 实验测定了1~6月龄雄性和雌性BXSB小鼠血清中IgM和IgG类型的抗dsDNA抗体的水平,结果见图1。

     图 1BXSB小鼠血清(1∶50稀释)中IgM(Ⅰ)和IgG(Ⅱ)类型抗dsDNA抗体的水平

  Fig 1Anti-dsDNA antibodies of IgM(Ⅰ) and IgG(Ⅱ) in BXSB mouse serum (1∶50 dilution)(n=5)

  2.2 抗ssDNA抗体水平 实验同时测定了1~6月龄雄性和雌性BXSB小鼠血清中IgM和IgG类型抗ssDNA抗体的水平,结果见图2。

图2 BXSB小鼠血清(1∶50稀释)中IgM(Ⅰ)和IgG(Ⅱ)类型抗ssDNA抗体的水平

  Fig2 Anti-ssDNA antibodies of IgM(Ⅰ) and IgG(Ⅱ) in BXSB mouse serum (1∶50 dilution)(n=5)

  2.3 尿蛋白质浓度 实验结果显示,3月龄的雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度开始增加,并且鼠龄愈长,尿蛋白浓度愈加升高。而1~6月龄的雌性BXSB的尿蛋白浓度处于正常范围内(见图3)。

图3 BXSB小鼠尿蛋白质浓度

  Fig3 Level of urine protein in BXSB mice(n=5)

  2.4 血清BUN浓度 实验结果表明:只有6月龄的雄性BXSB小鼠血清BUN浓度显著升高,而1~5月龄的雄性BXSB小鼠和1~6月龄的雌性BXSB小鼠的血清BUN浓度无明显差异(见图4)。

图4 BXSB小鼠血清尿素氮浓度

  Fig4 Level of serum BUN in BXSB mice(n=5)

  3 讨论

  BXSB小鼠的SLE发病有其独特性。由于Y染色体上携带有Yaa基因(Ychromosome linked autoimmune acceleration)加速自身免疫反应使得雄鼠较雌鼠发病早且严重。达5个月龄时,雄鼠约有半数死亡[5]

  实验结果显示1~6月龄雌雄BXSB小鼠IgM类型的抗dsDNA抗体水平相当,且无明显的上下波动;虽然IgM类型抗ssDNA抗体水平相近,但随着鼠龄的增加有下降的趋势。可能是随着BXSB小鼠SLE的发展,IgM类型的自身抗体在向IgG类型转换。总体上讲雄性BXSB小鼠IgG类型的抗dsDNA,ssDNA抗体水平高于雌性小鼠,此现象可能与雄鼠的发病特点有关,因为IgG类型的自身抗体具有较强的致肾炎作用[6]。但是,IgG类型的抗dsDNA,ssDNA抗体水平并没有随鼠龄的增加而升高。不过,也不能排除BXSB小鼠体内产生的大量的IgG类型抗DNA抗体以免疫复合物的形式沉积于肾脏的可能性。我们曾经检测到2月龄雄性BXSB小鼠肾脏已有IgG类免疫复合物的沉积,但同龄的雌性BXSB无此变化。

  尿蛋白质浓度是反映肾炎的指标之一。图3显示雌性BXSB小鼠尿蛋白质浓度在1~6月龄之间基本处于较低水平状态。而雄性BXSB小鼠尿蛋白质浓度从3月龄开始高于雌性鼠,并随鼠龄的增加而逐步升高,提示肾炎病变不断加重。图4显示作为肾功能指标之一的血BUN水平在1~4月龄雌雄鼠之间无明显差别。从5月龄开始,雄鼠血BUN水平急剧升高,提示在肾炎之后出现肾功能障碍。相反,雌性BXSB小鼠无明显升高。

  实验结果表明:发病的SLE小鼠的IgM和IgG类型抗dsDNA、ssDNA抗体水平与尿蛋白质和血尿素氮浓度之间无明显相关性,单纯测定抗DNA抗体水平并不能完全反映疾病的严重程度。由此提示在诊断SLE或判断其发病程度时应测定多项实验指标,综合分析才能得出较为客观的结论。

  此外,在测定抗dsDNA抗体时用S1核酸酶处理DNA以去掉可能存在的单链DNA或单链DNA缺口。实验中还发现将dsDNA直接包被于新的NUNC酶标板上能得到较准确的结果。而用硫酸鱼精蛋白、甲基化小牛血清白蛋白以及多聚赖氨酸间接吸附了dsDNA和不吸附dsDNA时测得同份血清的OD值相同,并没有显示出结合抗dsDNA的抗体水平,此与文献报道[7]的相符。因此,在测定抗dsDNA抗体时应引起注意。■

  基金项目:高校博士点专项科研基金资助项目,教技发中心[1999]26号

  作者简介:徐志伟(1964-),男,博士生,主要从事自身免疫病的分子机理研究。

  参考文献:

  [1]MOHAN C,DATTA SK.Lupus:Key pathogenic mechanisms and contributing factors[J].Clin Immunol Immunopathol,1995,77:209~220.

  [2]J 萨姆布鲁克,EF傅里奇才,T曼尼阿蒂斯,等.金冬雁等译.分子克隆[M].第2版.北京:科学出版社,1992.954~956.

  [3]MADAIO MP,HODDER S,SCHWARTZ RS,et al.Responsiveness of autoimmune and normal mice to nucleic acid antigens[J].J Immunol,1984,132:872~876.

  [4]李影林.中华医学检验全书(上册)[M].北京:人民卫生出版社,1996.466~467.

  [5]THEOFILOPOULOS AN,DIXON FJ.Murine models of systemic lupus erythematosus[J]. Adv Immunol, 1985,37:269~390.

  [6]IZUI S,IWAMOTO M,FOSSATI L,et al. The Yaa gene model of systemic lupus erythematosus[J].Immunol Rev,1995,144:137~154.

  [7]KROUBOUZOS G,TOSCA A,KONSTADOVL-AKIS MM, et al. Poly-L-lysine causes false positive results in ELISA methods detecting anti-DNA antibodies[J].J Immunol methods,1992,148:261~263.

收稿日期:1999-06-02;

修回日期:1999-10-20



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