当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 临床医学与专科论文 > 检验医学 > 间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究

间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究

来源:免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
336*280 ads

摘要: 间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究 免疫学杂志 1999年第4期第15卷 技术与方法 作者:邓瑞春 白云秀 张明伟 汪劲松 黄 英 毛 宁 单位:军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850 关键词:酶联免疫吸附测定 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 大肠杆菌 摘 要 采用大肠杆菌DH5α菌体蛋......


间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究

免疫学杂志 1999年第4期第15卷 技术与方法

作者:邓瑞春 白云秀 张明伟 汪劲松 黄 英 毛 宁

单位:军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850

关键词:酶联免疫吸附测定 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 大肠杆菌

  摘 要 采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清,建立了间接ELISA方法。经初步测定,该方法的灵敏度为0.5ng/ml,比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3 000倍,比银染色方法的灵敏度高150倍。在20~620ng/ml范围内测定呈直线关系,直线相关系数为0.895。经8次重复测定,显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。

  中图号 R371-34

  DETERMINATION OF THE E.COLI DH5α PROTEIN REMAINS IN

  GENIC ENGINEERING SEMI-FINISHED PRODUCT GM-CSF

Deng Ruichun, Bai Yunxiu, Zhang Mingwei, Wang Jinsong, Huang Ying, Mao Ning

  (Read Four-Ring Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)

  Abstract The antiserum were prepared against the total DH5α protein by immunizing rabbits, and then a method was established to determine the remnants E.coli DH5α protein in the gene engineering semi-finished pro-duct of rhGM-CSF. The sensitivity is about 0.5ng/ml, 3 000 times higher than that of Coomasie Briliant Blue stai-ning and 150 times than that of silver staining of PAGE. The linear range of the method is between 20-620ng/ml and the correlation coefficient(r) is 0.985, and repeativity is good.

  Key words Enzyme-liked immunosorbentassay(ELISA),Recombine human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF), Escherichia coli(E.coli)

  大肠杆菌DH5α是目前原核细胞表达系统中,应用最普遍的基因工程菌之一。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、人重组白细胞介素-2(rhIL-2)、人重组干扰素-α(rhIFN-α)等多种外源基因,都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产品在临床上的大量应用,对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有:聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),毛细管电泳(CE),等电聚焦(IEF),HPLC(包括凝胶过滤,各种反相HPLC,离子色谱,疏水色谱等)。此外,还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法,它简便、快速、灵敏、经济,是一种非常值得推广的方法。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  大肠杆菌DH5α菌体蛋白,由本室培养制备;HRP-羊抗兔IgG,购自本院微生物流行病学研究所;Western印迹试剂盒,购自Sigma公司;卡介苗,购自北京生物制品所。BDSL Immunoskan 340型酶联仪,英国;电泳仪,购自北京六一仪器厂。

  1.2 方法

  1.2.1 大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定[3,4]:于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α,经离心收集菌体,生理盐水洗2次,超声破碎,离心15 000r/min 10min,收集上清菌体蛋白,紫外分光光度法测定蛋白光吸收值,通过公式:mg/ml蛋白=1.45×OD280-0.74×OD260计算含量,SDS-PAGE对DH5α菌体蛋白成分进行分析。

  1.2.2 大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫:于免疫前1周,兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0.7mg,取4mg大肠杆菌DH5α菌体蛋白与1ml福氏完全佐剂混合,制成乳剂,于背部皮下多点免疫;2周后,注射不完全佐剂,免疫原剂量同前。随后,每隔2周加强1次,连续注射3次,最后1次自腹腔注射9mg抗原蛋白。7d后放血,收集血清,分装,于-20°C保存。

  1.2.3 抗体效价测定:按文献[1]琼脂糖免疫双相扩散法。制备1%琼脂糖胶,铺板,打梅花孔。中心孔加1mg/ml菌体蛋白,周边孔加入倍比稀释的抗血清,放湿盒中,48h后观察结果。

  ELISA方法按文献[1]的方法。抗原包被量为4μg/ml,HRP-羊抗兔IgG的使用浓度为1 000倍稀释,底物为邻苯二胺。

  1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳:按文献[3]进行。分离胶浓度8%,浓缩胶浓度5%。电极缓冲液25mmol/L Tris-192mmol/L甘氨酸。

  1.2.5 银染方法:将电泳胶用50%乙醇-12%醋酸固定20min,10%乙醇-5%醋酸洗3次,每次10min。取0.25% K2Cr2O7溶液浸泡7min,用去离子水洗2次,每次2min。将电泳胶浸泡于0.2% AgNO3溶液中,在20W日光灯下爆光20min,关灯放置20min,期间摇动若干次,至无色为止。无离子水洗3次,每次0.5min于摇动中加入0.28mol/L Na2CO3-0.05%甲醛,2~3次,视显色情况而定。1%醋酸定影10min,然后保存于去离子水中。

  1.2.6 Western印迹实验:见参考文献[3]。电泳分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上,封闭膜上非特异性结合位点,加入兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白血清,清洗后加酶标二抗,温育后清洗,用3.3′-二氨基联苯胺(DAB)染色。

  1.2.7 免疫电泳:见参考文献[1]。

  1.2.8 测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白的间接ELISA分析法:用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释的DH5α抗原溶液包被聚苯乙烯板,放4°C过液,次日用PBST洗涤3次,每次振荡3min。3% BSA-PBST封闭,37°C温育1h,同上洗涤。加入用1%BSA-PBST稀释的兔抗DH5 α抗血清,37°C温育1h,同上洗涤。加1%BSA-PBST配制的HRP-羊抗兔IgG,37°C温育1h,同上洗涤。加底物液,避光反应20min, 2mol/L H2SO4终止反应后,492nm测定吸光度。

  2 结果与分析

  2.1 抗血清效价测定 用DH5 α全菌蛋白作为抗原,免疫7只家兔,每只家兔免疫5次,所用抗原量分别为:4,4,4,10和9mg。用琼脂糖免疫双扩散法测定抗体效价。从表1可见,当免疫第3次(约定42d)时,抗体效价即可达1∶64倍,第4次时可达1∶128倍。但免疫到第5次时并未见效价继续升高。

表1 兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白抗血清效价

  Tab 1 The titer of the antisera against the total DH5α proteins

Animal number Immunodiffusion ELISA (104
Third Fourth Fifth
1 1∶64 1∶128 1∶128 1∶512
2 1∶64 1∶128 1∶128 1∶512
3 1∶64 1∶128 1∶128 1∶512
4 1∶64 1∶128 1∶128 1∶512
5 1∶16 1∶64 1∶64 1∶512
6 1∶64 1∶128 1∶64 1∶256
7 1∶16 1∶32 1∶128 1∶512

  表中还列出了ELISA法测定结果,即:除第6号家兔抗体效价稍低(1∶256×104)外,其余6只家兔抗体效价均达到1∶512×104。说明我们已经制备了高效价的抗血清。

  2.2 抗体特异性测定 图1为琼脂糖免疫电泳结果。7只家兔抗血清与抗原之间都能产生沉淀线,但不同个体所产生的沉淀线深浅度并不一样,这说明不同个体对不同抗原的免疫反应强度不同。该结果提示:在将抗体作为免疫诊断试剂使用时,应使用混合血清的抗体,这对保证所建方法有好的重复性,具有十分重要的意义。

图 1琼脂糖免疫电泳

  Fig 1Agrose immunoelectrophoresis

  ①~⑦ antisera of rabbits to E.coli DH5 α proteins respectively;⑧ The mixture of the seven rabbits antisera; ⑨The total DH5α proteins

  图2为DH5α菌体蛋白与抗体间的免疫印迹反应。首先,本实验免疫的7只家兔的抗血清,与抗原蛋白之间都能产生免疫印迹条带,说明每种抗原都已刺激机体产生了相应的抗体。换句话说,我们制备的抗体,能与任何DH5α抗原反应。但与GM-CSF之间没有免疫印迹条带出现。说明这些抗体不与GM-CSF反应。可见,我们制备的抗体,不仅效价高,而且特异性好,它能特异地与GM-CSF等基因工程产品的宿主蛋白反应,但不能与这些基因工程产物反应。

  2.3 方法的灵敏度、重复性和标准曲线 用间接ELISA方法测定该方法的灵敏度,结果见表2。从表2可见,当抗体稀释5×104倍时,可测抗原浓度为0.5ng/ml。显示该方法具有较好的灵敏度,实验共重复8次,说明该方法具有很好的重复性。

图 2DH5 α与抗体间的免疫印迹反应

  Fig 2The western blot betwean DH5α and antisera

  (1)~(7)antisera of rabbits to E.coli DH5 α proteins respectivily;(8)The mixture of the seven rabbits antisera;(9)Nor-mal rabbits serum; (10)、(12)GM-CSF;(11)Marker

  表2 ELISA法测定DH5 α菌体蛋白的灵敏度、重复性(抗体稀释5×104

  Tab 2 The sensitivity and respectivity of the ELISA method

  (The antibody is diluted 5×104

Concentration of antigen(ng/ml) A492nm(
10000 3.027±0.081
3300 2.739±0.099
1100 2.197±0.163
370 1.235±0.085
120 0.519±0.079
40 0.182±0.037
14 0.065±0.021
5 0.027±0.010
1.5 0.016±0.004
0.5 0.008±0.004
0.17 0.007±0.007
Ctrl 0.001±0.006

  2.4 ELISA法测定DH5 α的标准曲线 从图3可见,在20ng/ml到620 ng/ml范围内呈直线关系,直线回归系数为0.985,说明在此直线范围内,测定的结果比较接近。

  2.5 与PAGE方法比较 将DH5α蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,进行考马斯亮兰染色和银染,前者最小检测值为1 500ng/ml,后者最小检测值为75ng/ml。两种方法检测灵敏度分别低于本实验建立的ELISA方法(0.5 ng/ml)3 000倍和150倍。进一步说明本实验建立的方法具有较好的灵敏度。适合于基因工程产品中残余蛋白的检测。

图 3间接ELISA法动力学曲线

  Fig 3The kinetic curve of indirect ELISA

  3 讨论

  大肠杆菌DH5α在基因工程产品中的残余量,直接影响到产品的质量。快速准确地测定DH5α的残余量,对产品的质量控制具有重要意义,其检测方法尚在不断改进和完善。目前常用的SDS-PAGE法灵敏度较低,且操作繁琐,耗时较长。毛细管电泳和高效液相色谱法虽然灵敏度较高,但需昂贵仪器,非一般实验室所能接受。

  本文建立的间接ELISA方法,通过对DH5α蛋白及rhGM-CSF样品进行初步测量显示:它的灵敏度很高,可测定0.5 ng/ml菌体蛋白量,比现在常用的聚丙烯酰胺的考马斯亮兰染色方法的灵敏度高3 000倍,比银染色方法灵敏度高150倍。标准曲线范围在20~620 ng/ml,直线回归系数为0.985。重复性、稳定性都较好,方法简便、快速。我们认为,该方法可以应用于基因工程产品中菌体蛋白残余量检测。

  (致谢 本文曾得到丁广志教授和樊玉伟同志的热情帮助,特此致谢。)

  第一作者:女,37岁,硕士,助理研究员

  参考文献

  1 李成文.现代免疫化学技术.上海:上海科学技术出版社,1990.8

  2 张龙翔,吴国利.高级生物化学实验选编.北京:高等教育出版社,1989.9

  3 J.萨母布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁、黎孟枫、侯云德等译,北京:科学出版社,1992

  4 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术.第2版.北京:高等教育出版社,1997

(1998-09-23收稿;1999-03-16修回)



医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: