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A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

来源:免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较 免疫学杂志 1999年第2期第15卷 技术与方法 作者:邓瑞春张明伟白云秀汪劲松黄 英毛 宁 单位:军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850 关键词:A蛋白。抗体 摘要比较Hitrap Protein-A Sepharose亲和层析系统,对不同动物血清或抗血清的纯化效率,提......


A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

免疫学杂志 1999年第2期第15卷 技术与方法

作者:邓瑞春 张明伟 白云秀 汪劲松 黄 英 毛 宁

单位:军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850

关键词:A蛋白;亲和层析柱;抗体

    比较Hitrap Protein-A Sepharose亲和层析系统,对不同动物血清或抗血清的纯化效率,提供抗体纯化提供依据。结果显示该方法简便快速,纯化的抗体纯度高,并能较好地保持免疫学活性。层析柱反复使用40多次,纯化效率不变。但Protein-A对不同动物血清的IgG吸附能力不同。提示,应根据动物品种,选择合适的纯化方法。

  中图号 R371-33

COMPARISON OF IgG PURIFICATION FROM

  DIFFERENT ANIMAL SERA BY HITRAP PROTEIN

  A AFFINITY CHROMATO-GRAPHY

Deng Ruichun,Zhang Mingwei,Mao Ning

  (Beijing Read & Four-Ring Institute of Biotechnology,Beijing 100850)

  Abstract Several kinds of IgG from different animal sera or antisera were purified by Hitrap protein A affinity chromatography,and their purities were compared.The results show that Hitrap protein A affinity chromatography might be an easy and efficient way to purify IgG.The Hitrap gel still works well in adsorbing the IgG after a long time use.But there are some difference among the ability of absorption of IgG from different sera.

  Key words Protein A,Affinity chromatography,Antibody

  抗体现已广泛应用于生命科学的许多领域,尤其在疾病的诊断治疗和基础研究中发挥了越来越重要的作用。因为含有抗体的血清中有许多杂蛋白等,一般都需要先将抗体分离纯化。本文在比较了辛酸法和离子交换凝胶过滤法的基础上,进一步对Protein-A Sepharose affinity Chromatography进行了比较研究,现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

  正常鼠血清、正常豚鼠血清、正常人血清、羊抗鼠血清、驴抗兔血清、兔抗大肠杆菌DH5α血清均由本室自制;Hitrap Protein-A Sepharose affinity columns(Pharmacia瑞典);过氧化物酶(简称HRP,RZ=3 sigma USA)。

  紫外分光光度计(BECKMAN DU-600);电泳仪和电泳槽(北京六一仪器厂);酶联免疫测定仪(BDSL Immunoskman 340型);超滤器(MICON8010);激光扫描仪(Pharmacia LKB Ultrosan)

  1.2 方法

  1.2.1 抗体纯化:将1ml的HiTrap Protein-A Sepharose affinity column固定在铁架台上。用至少6倍体积的去离子水或起始缓冲液,洗出保护剂溶液。然后用2倍柱床体积的起始缓冲液平衡柱子,测定洗出液与起始缓冲液pH相同时,用注射器将血清样品注入,同时收集流出液。用至少8倍体积的0.02mol/L,pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白,收集洗脱液。用至少6倍体积的0.1mol/L,pH3.0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG,同时收集样品。测定280nm和260nm吸光度。

  1.2.2 抗体纯度鉴定[1]

  1.2.3 蛋白浓度测定[2]:根据下列公式计算蛋白含量:mg/ml=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm

  1.2.4 纯化样品的浓缩采用超滤法。

  1.2.5 HRP标记IgG[3]

  1.2.6 双抗体夹心ELISA法[4]

2 结果和讨论

2.1 纯度测定 按本文所报告的实验条件,分别收集PB洗脱部分和柠檬酸缓冲液洗脱部分。所得样品进行PAGE电泳,测定IgG纯度及抗体的回收量。结果见图1。

图 1 纯化各步洗脱样品PAGE图

  Fig 1 PAGE

  ①~⑥PB buffer elution fraction from goat anti-mouse serum,mouse serum,donkey anti-rabbit serum,human serum,guineapig serum,rabbit anti-DH5 α serum respectivily;(1)~(6)citric acid buffer elution fraction from goat anti-mouse serum,mouse serum,donkey anti-rabbit serum,human serum,guineapig serum,rabbit anti-DH5 α serum respectivily

  图2为HiTrap Protein-A Sepharose affinity column纯化兔抗大肠杆菌DH5α的柠檬酸缓冲液洗脱部分,经PAGE电泳后的激光扫描结果。

图 2 豚鼠血清的柠檬酸缓冲液洗脱部分的激光扫描结果

  Fig 2 Effect of laser scanning PAGE citric acid buffer elution fraction of guineapig serum

  表1列出了其它几种动物纯化效果。

表1 各步洗脱样品IgG的含量比

  Tab 1 Ratios of IgG content of pB and citric acid elution fraction

Serum PB buffer Citric acid buffer

  igG(%)

Guineapig serum 14.32 100
Human serum 25.06 100
Donkey anti-rabbit serum 36.87 100
Rabbit anti-DH5α serum 7.55 96.92
Mouse serum 30.74 94
Goat anti-mouse serum 42.49 88

  从图1和表1可见:首先,PB洗脱部分,羊、小鼠、驴、人血清中仍有大部分IgG没能被回收,而豚鼠、兔的IgG含量却很少。说明,Protein-A对前几种动物的IgG吸附能力弱,使得部分IgG随PB洗脱掉,降低了IgG的回收率;而对后两种动物IgG回收效果较好。其次,从柠檬酸缓冲液洗脱部分,豚鼠、人、驴的IgG纯度均达到一条带,即含量均100%,小鼠、羊除γ球蛋白带以外,在白蛋白部位还有较浅的蛋白带。

  图2例举的是用Protein-Asepharose affinity column纯化豚鼠血清的激光扫描结果,可见IgG纯度为100%。

  上述结果显示,Protein-A对动物血清IgG具有特异吸附能力,而对血清其它成分吸附能力很弱。这种特性可能与Protein-A的结构有关,即:Protein-A有6个不同的区域,其中5个与IgG的Fc区有强的结合能力,所以它能特异吸附IgG。但是,Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同。这一结果可能因为不同动物IgG的Fc区结构不同,从而造成Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同的现象。

  2.2 IgG的回收 表2为Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量。从表2可见,正常人、豚鼠、兔抗DH5α血清IgG的回收量都较高,而羊抗鼠、正常小鼠、驴抗兔的血清IgG回收量则较低,这一结果与上述电泳结果一致。此结果与文献报道的结果也基本一致。只是小鼠的结果略有不同,即Hitrap affincity culunm说明书为不吸附,本实验结果则为弱吸附。用此亲和层析系统还对驴血清进行了纯化,结果显示,Protein-A对驴的IgG有中等强度的吸附。此结果,尚未见文献报道。

表2 Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量

  Tab 2 Recovery amount of IgG

Serum Amount(ml) Times Mean recovery amount

  of IgG(mg/ml)

Guineapig serum 1 4 7.44
Human serum 1 4 9.40
Donkey anti-rabbit serum 1 4 5.0
Rabbit anti-DH5α serum 1 16 8.97
Mouse serum 1 5 3.74
Goat anti-mouse serum 1 5 2.47

  此外,IgG回收量与层析过程中上样量有关,通过对兔抗DH5α血清上样量进行比较,用1ml Hitrap protein A Sepharose亲和层析柱,上样量以1ml为宜。当上样量大于2ml时,IgG回收量与1ml上样时相差不大,这说明上样量过大时,可能超过了Protein-A对IgG的吸附限度,因而造成IgG的浪费。

  2.3 Protein-A Sepharose使用次数测试及效果观察 我们使用1ml Protein-A Sepharose层析系统对各种不同动物血清共进行43次(44.5ml)的抗体纯化,抗体的纯化效率未见改变。以兔抗DH5α为例,在第3~13次时,抗体的平均回收率为每毫升血清9.0mg,到了第37~38次时,抗体的回收率为每毫升9.5ml。前后几次,抗体的纯度均达到电泳一条带的纯度。说明,该层析柱具有较好的稳定性,能耐受强酸的反复处理。这一特点,可以大大提高层析柱的使用效率,降低使用成本。

  2.4 与辛酸法和离子交换凝胶过滤法比较 以前,我们曾报导过用辛酸法和离子交换凝胶过滤法纯化抗体的效果比较,现将3种方法纯化抗血清的某些特点总结于表3。从表3可见,亲和层析法纯化的抗体纯度高、时间短效率高、再生方法简单、抗体免疫活性好。所以是一种很有实用价值的纯化方法。

表3 3种纯化抗体方法比较

  Tab 3 Comparison of three methods for purification of antibody

Methods Purity Time Quantity Regenration of gel
Caprylic acid method >95% >12h A large No
Ion-exchange sephadex chromatography <90% >96h A small-medium Complex
Protein A affinity chromatography 100% <5min A small-medium Simple

  2.5 纯化抗体的初步应用 兔抗DH5α酶标抗体的应用:采用文献[3]的改良过碘酸钠氧化法,对上面纯化的兔抗DH5α抗体标记辣根过氧化物酶。4mgHRP与6mg兔抗DH5α结合,得2ml,共4.194mg的HRP-IgG。当包被兔抗DH52 IgG浓度为4μg/ml、DH52菌体蛋白浓度0.625ng/ml时,将此酶标抗体稀释4 000倍,测得A492nm为1.148。此结果进一步说明,用Protein-A Sepharose亲和层析柱纯化的抗体纯度高,并很好地保持了IgG的免疫活性,符合制备HRP标记抗体的标准。

  2.6 结论 Hitrap Protein-A Sepharose柱纯化抗体,纯度高、效率好。反复使用数十次,抗体纯度和活性不受影响。该层析系统对不同动物血清IgG有不同的吸附能力。这方面的数据应进一步积累,以便为抗体纯化工作提供选择依据。我们对该方法的实验条件进行了摸索,首先,各阶段洗脱体积都应适当加大,比如,按说明书上方法,要求使用5个柱床体积PB洗脱杂蛋白,但我们用此体积时,A280仍大于0.1,并未将杂蛋白完全洗净,所以我们使用的是8个柱床体积PB来洗脱杂蛋白。对上样量测试结果显示,1ml hitrap Protein A Sepharose每次上样1ml较为适宜,超过2ml可造成IgG的损失。作者简介 第一作者:女,37岁,硕士,助理研究员

  参考文献

  1 萨母布鲁J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指导.金冬雁,黎孟枫,等译.北京:科学出版社,1992

  2 方福德,周 吕,丁 濂,等.现代医学实验技巧全书(下册).北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995

  3 李成文.现代免疫化学技术.上海:上海科学技术出版社,1992

  4 汪濂主.现代医学实验方法.北京:科学出版社,1997

(1998-06-15收稿;1998-12-29修回)



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