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特异性抗人类白细胞抗原抗体的筛选与临床应用

来源:中华医学检验杂志 作者:谭建明… 2009-2-21

摘要: 关键词: 白细胞抗原。免疫【摘要】目的筛选特异性抗人类白细胞抗原(HLA)-IgG抗体,以评价肾移植受者的致敏状态。方法血清样本211份,采用微量酶联免疫法莱姆德抗原板(LAT)、混合抗原板(LATM)和补体依赖细胞毒(CDC)方法,随机双盲检测HLA抗体,比较其特异性与敏感性,分析3组肾移植受者的抗体水平。LAT特异性与敏感性为97。...


关键词: 白细胞抗原;肾移植;细胞毒性试验;免疫

  【摘要】目的 筛选特异性抗人类白细胞抗原(HLA)-IgG抗体,以评价肾移植受者的致敏状态。方法 血清样本211份,采用微量酶联免疫法莱姆德抗原板(LAT)、混合抗原板(LATM)和补体依赖细胞毒(CDC)方法,随机双盲检测HLA抗体,比较其特异性与敏感性,分析3组肾移植受者的抗体水平。结果 所有样本的检测均获成功。LATM重复性为100%;LAT特异性与敏感性为97.9%~100%、重复性为100%、变异系数(CV)为0.052~0.089;CDC特异性为88.4%、敏感性89.6%、重复性90%、CV为0.081~0.154。临床应用显示:移植肾功能衰竭组HLA抗体致敏率(88%)显著高于首次尸肾移植的术前水平(20%,P<0.01),差异有非常显著意义。50例LAT、LATM阴性受者,无一例发生超急性排斥反应。结论 LAT、LATM筛选抗HLA-IgG抗体明显优于CDC方法,适合于临床应用。

Specific anti-HLA antibody: detection and application

TAN Jianming, TANG Xiaoda, ZHU Zhongyong.

  renal Transplantation Center, Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou 350025, china

  【Abstract】Objective To screen the specific anti-HLA-IgG antibodies for evaluating sensitization in renal transplantation. Methods 211 sera were blindly detected using the new micro-ELISA Lambda antigen tray (LAT), Lambda antigen tray mixed (LATM) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) techniques to compare their specificity and sensitivity. Sensitization was analyzed in the recipients of the three groups. Results All samples were successfully determined by the new micro-ELISA and CDC assay. The reproducibility was 100% for LATM assay. The specificity and sensitivity were 97.9%~100% for LAT technique, and the reproducibility was 100% with CV from 0.052 to 0.089. The specificity however was 88.4%, and the sensitivity was 89.6%. The reproducibility was 90% with CV from 0.081 to 0.154 for CDC test. Clinical application showed that the sensitization of HLA antibody was higher in retransplants with hemodialysis(88%) than in first pre-Tx recipients (20%) (P<0.01). No hyperacute rejection occurred in 50 recipients with negative-LAT and negative-LATM. Conclusion New micro-ELISA of LAT and LATM screening IgG anti-HLA antibodies is more precise than CDC method in clinical practice.

  【Key words】HLA antigens;Kidney transplantation;cytotoxicity tests, immunologic

  特异性抗人类白细胞抗原(HLA)抗体的筛选,是实质性器官移植术前最主要的组织相容性试验之一,对预防超急性排斥反应、监测受者的免疫状态、提高移植物存活具有重要意义。目前临床常用的补体依赖性细胞毒试验(CDC),难以分辨出抗体的特异性,结果受其他抗体干扰。近年酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测特异性抗HLA抗体取得重要进展。我们采用1998年美国加州大学研制的莱姆德抗原板(LAT)和混合抗原板(LATM)技术[1],筛选HLA抗体,与CDC方法进行双盲比较,并用于临床检测肾移植受者的HLA抗体水平,报告如下。

  材料和方法

  一、样本

  移植肾的功能衰竭(血肌酐>500 μmol/L, 简称失功)并恢复血液透析者的血清85份,首次尸肾移植术受者术前和术后血清各63份。取外周血3 ml,分离血清,置-80℃保存。

  二、测定方法

  1. LAT、LATM检测技术:依据ELISA原理,采用不同的HLA抗原包被泰萨奇(Terasaki)板,以特异性检测抗HLA-IgG抗体。其中LATM为Ⅰ类A、B、C抗原和Ⅱ类DR、DQ抗原混合,各组成2个试验孔,是定性检测。LAT为Ⅰ类A、B、C抗原组成28个试验孔、Ⅱ类DR、DQ抗原组成12个试验孔,是定性与定量分析。主要方法包括:稀释标准阳性血清和待测血清,分别加入96孔Terasaki板,1 h后洗板,再加辣根过氧化物酶交联的IgG二抗,45 min后洗板,加入底物避光显色20~25 min终止,1 h内测定各孔的吸光度值(A630nm)。仪器为可用于Terasaki板测定的Bio-Tek800NB型酶标仪。计算机自动分析Ⅰ类、Ⅱ类IgG抗体的水平和特异性[1]

  2.CDC方法:将表达不同的HLA-Ⅰ类抗原活的淋巴细胞包被Terasaki板,并冷冻制成细胞板,根据补体介导的抗原抗体反应原理,显微镜下观察死亡淋巴细胞的比例,以判断抗体的水平[2]

  三、结果分析与统计学处理

  计算机自动分析LAT、 LATM测定结果;CDC阳性值为淋巴细胞死亡数≥40%(评分4分以上)。比较LATM、LAT与CDC测定结果的特异性和敏感性,并进行χ2检验

  结果

  一、特异性抗HLA抗体的测定结果

  临床样本211份,随机双盲LATM、LAT和CDC 3种方法检测,均获得有效测定结果(表1)。其中LATM可确定是否存在HLA抗体;LAT既可确定抗体水平,又可分辨其特异性;CDC只能确定抗体水平,难以分辨抗体的特异性。

表1 3种方法检测HLA抗体结果比较(例)

混合抗原板法结果 例数 莱姆德抗原板法-Ⅰ类 莱姆德抗原板法-Ⅱ类 补体依赖细胞毒试验
<10% 10%~ ≥80% <10% 10%~ ≥80% <10% 10%~ ≥80%
Ⅰ类阳性/Ⅱ类阳性 59 1 22 36 0 24 35 4 31 24
Ⅰ类阳性/Ⅱ类阴性 36 1 19 16 34 2 0 7 23 6
Ⅰ类阴性/Ⅱ类阳性 10 10 0 0 0 6 4 6 4 0
Ⅰ类阴性/Ⅱ类阴性 106 106 0 0 105 1 0 95 11 0
合计 211 118 41 52 139 33 39 112 69 30

  二、方法学比较

  1.LAT与LATM结果比较:1份血清LATM阳性而LAT为阴性;2份血清LATM阴性而LAT为阳性。总体比较:Ⅰ类抗体阳性相符率(特异性)97.9%(93/95)、Ⅰ类抗体阴性相符率(敏感性)100%(116/116);Ⅱ类抗体阳性相符率(特异性)100%(69/69)、Ⅱ类抗体阴性相符率(敏感性)97.9% (139/142)。

  2.CDC与LATM比较:9份血清LATM阳性而CDC为阴性;3份血清LATM阴性而CDC为阳性。10份血清LATM和LAT检测均为Ⅱ类抗体阳性、Ⅰ类抗体阴性,而CDC检测只有4份为阳性、另外6份为阴性。总体比较:Ⅰ类抗体阳性相符率(特异性)88.4%(84/95)、Ⅰ类抗体阴性相符率(敏感性)89.6%(95/106)。CDC无法检测Ⅱ类抗体。

  三、肾移植临床应用结果比较

  移植肾失功组HLA抗体致敏率LATM 88.2%(75例)、LAT 87.1%(74例)、CDC77.6%(66例),明显高于首次尸肾移植术前的致敏率(LATM 20.6%、LAT22.2%、CDC 20.6%),差异有非常显著意义(χ2为60.75, p<0.01);术后的致敏率略有升高(LATM 26.9%、LAT 28.6%、CDC 31.7%),但与术前比较差异无显著意义。

  四、重复性试验

  HLA抗体阳性和阴性血清各5份,重复检测5次,重复性试验结果为:LATM重复性100%;LAT阳性率重复性100%,抗体水平值CV为0.052~0.089;CDC阳性率重复性90%(45/50),CV为0.081~0.154。

  讨论

  移植受者体内预存抗体,尤其是特异性抗HLA抗体,是影响移植物存活和排斥反应的重要因素。术前筛选出这些抗体具有重要临床意义而倍受重视[4]。目前的筛选技术有两大类:一是基于CDC方法的配组反应性抗体检测[5]。二是ELISA方法[1,3],该技术既可检测出特异性抗HLA-IgG抗体,又可分辨其特异性,适合临床应用。

  我们采用LAT、LATM技术筛选肾移植受者抗HLA抗体,并与传统的CDC方法进行比较。旨在提出适合于临床需要和我国国情的HLA抗体筛选方法。211份样本的测定结果显示:LATM快速、简捷,价格低廉,重复性好,可同时检出Ⅰ、Ⅱ类抗体,但不能分辨其特异性,适合于大样本的定性筛选。LAT快速、准确,特异性和敏感性均超过97.9%,可同时确定抗体水平并分辨其特异性,但价格较昂贵,适合于LATM阳性受者的定量分析。CDC方法特异性与敏感性接近90%、重复性90%,只能检测出Ⅰ类抗体,且存在假阴性和假阳性,结果判断受主观因素干扰。临床应用结果表明:50例术前LATM和LAT阴性的受者,术后无1例发生超急性排斥反应或加速性排斥;2例术前LAT≥80%的受者,术后1例发生加速性排斥、另1例出现二次急性排斥。移植肾失功者,HLA抗体致敏率达88%,半数抗体水平≥80%。提示再次移植者筛选HLA抗体尤为重要。

  从我国器官移植的实际情况出发,我们建议,先采用LATM作为定性筛选试验,对抗体阳性者,再采用LAT确定抗体水平并分辨其特异性。

  基金项目:卫生部科研基金资助项目(98-1-314)

参考文献

  1 Wang G, Tarsitani C, Denham S, et al. A new micro-ELISA for anti-classⅠand classⅡ antibody detection. Human Immunol,1998, 59: 133-135.

  2 Hopkins KA. The basic microlymphocytotoxicity assay. In: Zachary AA, teresi GA, eds. The ASHI laboratory manual. 2nd. Lenexa: ASHI, 1990.195-201.

  3 Buelow R, Mercier I, Glanville L, et al. Detection of panel reactive anti-HLA classⅠ antibodies by ELISA assay or lymphocytotoxicity: results of a blinded, controlled multicenter study. Human Immunol, 1995, 44: 1-11.

  4 Moore SB, Ploeger NA, DeGoey SR. HLA antibody screening. Transplantation,1997, 64: 1617-1620.

  5 Rosenberg JC. IgM antibodies continue to confuse crossmatch assays. In: terasaki PI, ed. The 11th clinical histocompatibility workshop. Los Angeles: uCLA Tissue Typing Laboratory, 1996. 40-45.



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