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活化淋巴细胞与慢性GVHR诱导的SLE样小鼠模型的比较

来源:中国免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 活化淋巴细胞与慢性GVHR诱导的SLE样小鼠模型的比较 中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 学术会议优秀论文 作者:郭玲吴厚生胡新美 单位:郭玲(上海医科大学免疫学教研室,上海200032)。活化淋巴细胞 摘要目的:将本室建立的用活化淋巴细胞诱导的系统性红斑狼疮(SLE)样小鼠模型与国际上公认的用慢性GVHR诱导......


活化淋巴细胞与慢性GVHR诱导的SLE样小鼠模型的比较

中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 学术会议优秀论文

作者:郭玲 吴厚生 胡新美

单位:郭玲(上海医科大学免疫学教研室,上海200032);吴厚生(上海医科大学免疫学教研室,上海200032);胡新美(上海医科大学免疫学教研室,上海200032)

关键词:系统性红斑狼疮样小鼠模型;抗核抗体;慢性移植物抗宿主反应;活化淋巴细胞

  摘 要 目的:将本室建立的用活化淋巴细胞诱导的系统性红斑狼疮(SLE)样小鼠模型与国际上公认的用慢性GVHR诱导的SLE样小鼠模型进行比较,进一步探索SLE的发病机理。方法:分别将亲代Balb/c小鼠淋巴细胞经静脉和用ConA 活化的(Balb/c×C57BL/6)F1代小鼠淋巴细胞经皮下途径输入F1代小鼠,用ELISA测定IgG类抗dsDNA抗体和抗组蛋白抗体,用免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)荧光核型和肾小球内免疫复合物沉积,用免疫印迹法检测抗可溶性核抗原(ENA)抗体。结果:亲代淋巴细胞免疫F1代小鼠所致的慢性GVHR和活化F1代小鼠淋巴细胞均可诱导F1代小鼠产生高滴度的抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体等ANA,并且肾脏都有明显的IgG类免疫复合物沉积。但亲代淋巴细胞免疫组ANA核型以颗粒型、核仁型为主,ENA多肽谱多在32、47、67 kD处显色;而活化淋巴细胞免疫组以胞浆型、周边型、均质型为主,ENA多肽谱在28、47、67 kD处显色。结论:这2种方法均可诱导出SLE样综合征,但其抗核抗体谱有所不同。

  中国图书分类号 R730.52

Comparison SLE-like mouse “model” by chronic graftversus-host reaction with activated lymphocytes

GUO Ling,WU Hou-Sheng,HU Xin-Mei

  (Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)

  Abstract Objective:To compare two SLE-like mouse“model”induced by chronic graftversus-host reaction and activated lymphocytes.Methods:Inoculation of (BALB/c×C57BL/6)F1 generation mice separately with lymphocytes from parental strain mice by intravenous injection and with activated lymphocytes from F1 mice by subcutaneous injection.Levels of serum IgG autoantibody to dsDNA and total histones were determined by ELISA method.Anti-nuclear antibodies and immune complex in glomeruli were observed by immunofluorescent stain,antibodies against extractable nuclear antigens were determined by immunoblot assay.Results:Anti-dsDNA antibodies and anti-histone antibodies were induced by both lymphocytes activated by ConA and lymphocytes from parental strain mice.Anti-DNA antibody positive mice had marked immune complex deposits in glomeruli.Conclusion:The results suggest that these two methods all induce SLE-like syndrome and their ANA spectrum is slightly different.

  Key words Systemic lupus erythematosus mouse model  Chronic graftversus-host reaction Antinuclear antibodies Activated lymphocyte

  系统性红斑狼疮是自身免疫性疾病的原型,其主要免疫学特征是血液中含有以IgG类抗dsDNA抗体、抗Sm抗体为代表的多种自身抗核抗体,免疫复合物在肾小球基底膜等处沉积。但SLE的发病机理迄今不明,动物模型的建立对SLE的研究有着极其重要的作用。目前国际至少有5种自发产生SLE样的狼疮小鼠模型,对无狼疮倾向性小鼠也可用外源性抗原诱导出SLE样综合征,有人认为T细胞对B细胞的旁路激活是SLE发病的机理[1],其证据就是慢性移植物抗宿主反应可诱导SLE样综合征[2]。我们在以前的实验基础上提出活化的淋巴细胞(包括T、B和NK细胞)核抗原的变化是SLE发病学的共同通路[3-5],是对旁路激活的深一层次的阐明。本文通过对活化淋巴细胞与慢性GVHR诱导抗核抗体(ANA)的比较,试图证明这二者ANA生成的机理是相同的,即慢性GVHR所致的SLE样综合征也与活化淋巴核抗原发生变化有关。

  1 材料与方法

  1.1 材料 小鼠品系:6~8周龄Balb/c(B/C,H-2d)雌性小鼠,C57BL/6(B6,H-2b)雄性小鼠,均购自上海生物制品研究所实验动物部。(B/C×B6)F1(H-2d/b)雌性小鼠,自行交配。dsDNA(小牛胸腺DNA),Sigma产品。组蛋白,购自上海第二医科大学单克隆研究室。ENA多肽谱试剂盒、Hep-2细胞抗核抗体核型检测试剂盒均购自上海第二医科大学仁济医院风湿科。

  1.2 亲代淋巴细胞的制备及免疫 无菌取Balb/c鼠胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结,用Tris-NH4Cl破坏红细胞,Hanks液洗涤3次,用台盼蓝检测细胞活力大于95%,调整细胞悬液至所需浓度。按5×107/只鼠经静脉途径输入F1小鼠体内,分别与第1,4,7,10天免疫小鼠,共4次。免疫前和末次免疫后每2 w经眶后静脉丛采血。分离血清,保存于-20℃。

  1.3 ConA活化的淋巴细胞的制备及免疫 无菌取F1鼠脾脏和肠系膜淋巴结,用Tris-NH4Cl破坏红细胞,用完全1640培养液调整细胞浓度为2×106 ml-1加ConA(终浓度5 μg/ml),于37℃,5%CO2培养72 h,经0.3%戊二醛灭活,按2×107个细胞/只鼠皮下注射,1次/w,计3次。血清采集同上。

  1.4 IgG类抗双链DNA抗体检测[6] 用ELISA方法检测IgG类抗dsDNA抗体生成。酶标板用0.5%硫酸鱼精蛋白预处理。经S1核酸酶(消化ssDNA)处理小牛胸腺DNA,按50 μg/ml包被抗原。血清样品按1∶50稀释。

  1.5 抗组蛋白抗体检测 用含0.1%牛清白蛋白pH9.6碳酸盐缓冲液溶解组蛋白,每孔5 μg,4℃过夜。其余同前。

  1.6 ENA多肽谱的检测 采用Western blot法,基本操作按试剂盒说明书进行。1.7 Hep-2细胞抗核抗体荧光核型的检测 采用间接免疫荧光法,基本操作根据试剂盒说明书进行。

  1.8 肾脏免疫病理检测 取小鼠肾脏做冰冻切片,用羊抗小鼠IgG荧光抗体染色(直接免疫荧光法)检测肾小球IgG类免疫复合物沉积。

  1.9 统计学方法 本试验数据采用方差分析及两样本均数比较的t检验进行统计学处理。

  2 结果

  2.1 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代淋巴细胞诱导F1代小鼠产生IgG类抗dsDNA抗体的比较 如表1所示,正常F1代小鼠和用未活化淋巴细胞免疫的F1代小鼠没有1例产生抗dsDNA抗体生成,而经亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代小鼠淋巴细胞免疫的F1代小鼠均检测到高滴度IgG类抗dsDNA抗体生成,按吸光度(A)值≥正常(A)值+3s为阳性,阳性率均为100%。ConA活化细胞免疫组和亲代淋巴细胞免疫组与未活化细胞免疫组进行统计学上的比较,P<0.01,差别有显著意义,而ConA活化免疫组和亲代淋巴细胞免疫组进行统计学上的比较,P>0.05,差别无显著意义。

  2.2 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代小鼠淋巴细胞诱导F1代小鼠产生IgG类抗组蛋白抗体的比较 正常F1代小鼠和用未活化淋巴细胞免疫的F1代小鼠没有1例产生抗组蛋白抗体;而经亲代淋巴细胞ConA活化的F1代小鼠淋巴细胞免疫的F1代小鼠均检测到高滴度抗组蛋白抗体,阳性率均为100%,见表2。ConA活化细胞免疫组和亲代淋巴细胞免疫组与未活化细胞免疫组进行统计学上的比较,P<0.01,差别有显著意义;ConA活化细胞免疫组和亲代淋巴细胞免疫组进行统计学上的比较,P>0.05,差别无显著意义。

表1 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代淋巴细胞诱导F1代小鼠产生IgG类抗dsDNA抗体

  Tab.1 Induction of anti-dsDNA IgG antibody by immunization with lymphocytes from partental strain mice and activated lymphocytes by ConA

Antigen source Number of mice Anti-dsDNA antibodies A( Anti-dsDNA antibodies positive rate
Control 8 0.056±0.044 0/8
Resting F1 spleen cells 8 0.078±0.032 0/8
F1 spleen cells activated with ConA 8 0.916±0.269 8/8
Spleen cells from parental strain mice 10 1.074±0.229 10/10

表2 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代淋巴细胞诱导F1代小鼠产生抗组蛋白抗体的比较

  Tab.2 Induction of anti-histone antibody by immunization with lymphocytes from parental strain mice and activated lymphocytes by ConA

Antigen source Number of mice Anti-dsDNA antibodies A( Anti-dsDNA antibodies positive rate
Control 8 0.043±0.025 0/8
Resting F1 spleen cells 8 0.067±0.038 0/8
F1 spleen cells activated with ConA 8 0.887±0.402 8/8
Spleen cells from parental strain mice 10 0.968±0.149 10/10

表3 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代小鼠细胞诱导F1代小鼠产生ANA荧光核型的比较

  Tab.3 Induction of ANA by immunization with lymphocytes from parental strain mice and activated lymphocytes by ConA

Mice ANA production Staining band of ENA(kD)
Immunization with ConA
activated lymphocytes
No.1 Peripheral pattern — —
No.2 Cytoplasmic pattern — —
No.3 Homogeneous pattern — —
No.4 Cytoplasmic pattern — —
No.5 Peripheral pattern — —
No.6 Homogeneous pateern — —
No.7 Cytoplasmic pattern — —
No.8 Speckled pattern — —
    28、47、67
Immunization with
lymphocytes from
parental strain mice
No.1 Speckled pattern 47
No.2 Centromcric pattern — —
No.3 Cytoplasmic pattern — —
No.4 Centromeric pattern — —
No.5 Speckled pattern 47、67
  Homogeneous pattern
No.6 Speckled pattern 47
No.7 Homogeneous pattern 32
No.8 Speckled pattern 13.5、18、22、67
No.9 Speckled pattern 47、55
No.10 Speckled pattern centromeric pattern 15、32、47、67

  note:— —:not do2.3 亲代淋巴细胞和ConA活化的F1代小鼠淋巴细胞诱导F1代小鼠产生ANA荧光核型的比较 用Hep-2细胞检测亲代淋巴细胞免疫组ANA的荧光核型,所有免疫组血清均ANA阳性,以核仁型、颗粒型为主,此外还可见周边型、均质型、着丝点型,即多种核型阳性。ConA活化细胞组免疫血清ANA荧光核型也均为阳性,但以胞浆型、周边型、均质型为主,此外还可见颗粒型(表3)。

  2.4 ENA多肽谱检测结果 用Western blot法检测了ANA呈颗粒型的8个免疫血清样品,结果显示:亲代淋巴细胞免疫组血清样品主要在32、47、67 kD有显色区带;ConA活化细胞免疫组血清样品则在28、47、67 kD有显色区带(见表3)。

  2.5 肾脏免疫病理的变化 用直接免疫荧光法检测IgG类抗dsDNA抗体阳性的小鼠,肾脏均有IgG类免疫复合物沉积,呈斑块状(见图1)。而抗dsDNA抗体阴性的小鼠则未见有肾内IgG类免疫复合物沉积。

图1 免疫复合物沉积于肾小球

  Fig.1 Immune complex deposits in glomeruli

  3 讨论

  GVHR有急性和慢性2种类型,前者是致死性的,后者伴SLE样综合征的发生。已知将C57BL/6小鼠T细胞输给(C57BL/6×DBA/2)F1代小鼠产生致死性GVHR,而将DBA/2小鼠T细胞输给F1代小鼠诱发的则是慢性GVHR伴SLE样改变[7]。我们用Balb/c小鼠替代DBA/2品系也同样诱导出SLE样改变(待发表)。Gleichmann等认为供受体Ia抗原不配对,移植物的CD4+T细胞与宿主B细胞之间异常协作,导致了受体B细胞多克隆激活和自身抗体生成,但近来认为,SLE的致病性抗核抗体是IgG类高亲和自身抗体,是由特异性抗原驱动产生的,而不是多克隆B细胞激活剂随机产生的[8]。因此T-B细胞异常协作尚不能解释IgG类高亲和力致病性抗体是如何生成的,同时也不能解释为什么慢性GVHR诱导的是SLE样改变而不是其它的自身免疫病。

  我室用不同原因活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原,免疫同系小鼠,均成功地诱导产生了包括IgG类抗dsDNA抗体在内的多种ANA。从活化淋巴细胞中提取的活化细胞核及活化染色质均可诱导产生IgG类抗dsDNA、抗Sm、抗RNP等多种抗核抗体,而未活化淋巴细胞及其细胞核、染色质则不能[9,10]。近来又发现从活化的细胞核中提取的DNA和组蛋白也有免疫原性(待发表)。综合上述实验,我们提出活化淋巴细胞的核成分可能是诱生包括抗dsDNA抗体在内的多种抗核抗体生成的真正免疫原,也可能是SLE发病学的共同道路。

  本实验中我们采用ConA活化的F1代小鼠T细胞,经灭活后作为免疫原诱导F1代小鼠产生了多种ANA,与慢性GVHR诱导的SLE样综合征相似,提示亲代淋巴细胞免疫也是激活了淋巴细胞,而其核抗原发生变化,才是驱动抗核抗体生成的真正免疫原,也是免疫复合物型肾炎生成的原因。T-B细胞间旁路激活只是活化中的一种现象,而活化引起核抗原变化才是本质。本实验中,我们注意到亲代淋巴细胞免疫组诱导的ANA,其免疫荧光核型以颗粒型和核仁型为主,而活化淋巴细胞免疫组是以胞浆型、周边型和均质型为主,这可能是由于活化了不同的核成分所引起。本实验室正在继续开展这方面的研究工作。

  课题受自然科学重点课题基金资助(39730430)

  作者简介:郭玲,女,28岁,助教,硕士,主要从事系统性红斑狼疮发病机理的研究

  参考文献

  1,高晓明.T细胞对B细胞的旁路激活及其与系统性红斑狼疮的关系.上海免疫学杂志,1998;18(2):69

  2,Datta S K,Schwartz R S.Autommunization and graft versus host reactions.Transplant Rev,1976;31:44

  3,卢 琳,奚华国,吴厚生.活化淋巴细胞及其活化染色质诱导抗核抗体生成.中华微生物学和免疫学杂志,1999;19(1):44

  4,卢 琳,李金柱,吴厚生et al.促丝裂原活化淋巴细胞诱导抗双链DNA抗体.上海医科大学学报,1997;25(4):250

  5,Wu H L.Activated lymphocytes and their active nuclei and chromatin are autoimmunogens to triger the production of anti-nuclear antibodies.J Allergy Clin Immunol,1998;101:S53

  6,吴金华,吴厚生.天然DNA和细胞因子对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞体外分泌抗双链DNA抗体的影响.上海医科大学学报,1994;21(2):109

  7,Feikje M,Rappard-Van D V,Thaddaus R et al.Attempts at standardization of lupusclike graft-vs-host diseae:inadvertent repopulation by DBA/2 spleen cells of H-2different nonirradiated F1 mice.J Immunol,1983;130(6):2693

  8,Rolink A G,Pals S T,Gleichmann E.Allousuppressor and allohelper-T cells in acute and chronic GVHD(II):FIR carrying mutations at H-2k and/or I-A.J Exp Med,1983;157:755

  9,Lu L,Li J Z,Wang M Y et al.Induction of anti-DNA antiboies by immunozation with activated lymphocytes & active chromatin.Clin Med J,1998;111(6):524

  10,Wu H S,Lu L,Li J Z et al.Induction of anti-DNA antibody by immunization with activated lymphocytes and their active chromatin.J Allergy Clin Immunol,1997;99:S191

[收稿2000-01-25,修回2000-04-26]



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