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抗U 1 RNP/Sm 抗体诱导人淋巴细胞凋亡的研究

来源:中国免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 抗U1RNP/Sm 抗体诱导人淋巴细胞凋亡的研究 中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学 作者:郭大文李晓军虞伟 武建国 单位:郭大文(第二军医大学研究生院,上海 200433)。武建国(南京军区南京总医院全军医学检验中心, 南京 210002) 关键词:抗U1RNP/Sm 抗体。细胞凋亡 摘要目的:研究抗U1RNP/Sm......


抗U1RNP/Sm 抗体诱导人淋巴细胞凋亡的研究

中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学

作者:郭大文 李晓军 虞伟  武建国

单位:郭大文(第二军医大学研究生院,上海 200433);工作单位:沈阳军区总医院检验科,沈阳110015;李晓军(南京军区南京总医院全军医学检验中心, 南京 210002);虞伟(南京军区南京总医院全军医学检验中心, 南京 210002);武建国(南京军区南京总医院全军医学检验中心, 南京 210002)

关键词:抗U1RNP/Sm 抗体;淋巴细胞;细胞凋亡

  摘 要 目的:研究抗U1RNP/Sm 抗体与人淋巴细胞凋亡的关系 。方法:将抗U1RNP/Sm自身抗体与人淋巴细胞共育,37℃ 48 h后用电 镜 观察抗体作用细胞凋亡的形态学改变;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞凋亡率,并与流式细胞术 进行比较。结果:电镜观察发现与抗U1RNP 或抗Sm抗体共育后的淋巴细胞发生典型凋亡形态学改变,瑞氏-姬姆萨染色计数凋亡率分别 为(9.95±2.15)%和(15.72±3.20)%,显著高于对照组(P<0.01),流式细胞术检测结 果与 形态学方法相符。DNA电泳出现典型梯状条带。结论:抗U1RNP /Sm 抗体具有诱导淋巴细胞凋亡的能力。

  中国图书分类号 R392.11

Effects of anti-U1RNP/Sm antibodies on apoptosis of human lymphocytes

GUO Da-Wen

  (The Graduate Institute, Second Military Med ical University,Shanghai 200433)

  LI Xiao-Jun YU Wei WU Jian-Guo

  (Department of Immunology, Center of Medical Laboratory Science of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command ,Nanjing 210002)

  Abstract Objective:Study of the effect of anti-U1RNP/Sm antibodies on apoptosis of human lymphocytes.Methods: The ultrastructural f eatures of apoptosis were observed with electron microscope and the percentages of apoptosis were measured by Wright-Geamsa staining.The correlation between th e results of staining and those of FACS analysis was compared.Results: Ultrastructural observations with electron microscope show ed characteristic features of apoptosis and the percentages of apoptosis measure d by Wright-Geamsa staining were notably increased compared with the controls〔

  Key words Anti-U1RNP/Sm antibodies Lymphocyte Apopto sis

  抗U1RNP抗体是混合性结缔组织病(MCTD)的特征性标志和诊断指 标之一,亦见于全身性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)等患者。抗Sm抗体则只见于SLE 患者,是SLE的 标志性抗体。二者相应的抗原分别为U1RNP和U1、U2 、U4/U6、 U5 RNP 。早 期 研究表明,抗RNP抗体可穿入活的淋巴细胞,清除T抑制细胞,引起免疫抑制功能低下而引发 抗核抗体的产生[1,2]。本文报道了对抗U1RNP/Sm自身抗体与细胞凋亡关系的 研究结果。

  1 材料与方法

  1.1 研究对象 阳性标本均获自我院诊断明确的门诊及住院患者 。免疫印迹和ELISA法筛选仅抗U1RNP 抗体阳性,其余抗ENA多肽抗体、抗ds-DNA抗体、A N A均阴性的MCTD(4例)、SLE(4例)血清和仅抗Sm 抗体阳性,其余抗ENA多肽、抗ds-DNA 抗 体、ANA均阴性的SLE(5例)血清。淋巴细胞和正常对照血清(6份)来自健康献血员。所有 血清标本均用50%饱和度硫酸铵盐析,提取γ球蛋白(γG)组分,免疫比浊法测定IgG含量 ,0.22 μm微孔滤膜除菌,-20℃保存。

  1.2 细胞分离与培养 按常法用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) 从正常人新鲜外周血中分离单个核细胞,RPMI1640(GIBCO)培养基洗3次,重悬于含10% 小牛血清-RPMI1640培养基中,调整细胞密度为1×106~2×106 ml-1,台盼蓝 拒 染率>96%。移入24孔培养板,1 ml/孔。实验分2组:A组各孔加抗U1RNP/Sm 抗体或正常 对 照血清γG,终浓度为1 mg/ml。B组各孔加PHA(100 μg/ml),培养48 h后加入上述浓 度的抗U1RNP/Sm 抗体或正常对照血清γG。于37℃、5%CO2温箱中培养48 h。

  1.3 瑞氏-姬姆萨染色观察 培养细胞用1%戊二醛固定,瑞氏-姬 姆 萨染色,光学显微镜检查。凋亡细胞体积缩小,细胞膜有出芽现象,可见凋亡小体,核固缩 ,可成新月形或块状,核内可见空泡。2人双盲观察,计数200个以上细胞,计算凋亡 率(Ap%)。

  1.4 电镜观察 细胞(1×107)用2.5%戊二醛固定2 h,1%锇酸 固定 1 h,树脂包埋,超薄切片,醋酸铀、枸橼酸铅染色,日立JEM1200-EX透射电镜观察。

  1.5 流式细胞术检测 采用细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC kit( 深圳晶美公司)及美国BD(Becton Dickinson)公司的流式细胞仪FACScalibur 检测细胞凋 亡。

  1.6 核酸电泳 洗涤培养细胞,重悬于200 μl TES(15 mmol/L Tr is·HCl,15 mmol/L EDTA,15 mmol/L NaCl,pH8.0)中,加40 μl 5 mol/L NaClO4, 充 分混匀,加100 μl 10% SDS,37℃ 10 min,然后转入65℃ 15 min。等体积酚、氯仿、异 戊醇(V∶V∶V= 25∶24∶1)抽提,上清加1/10体积3 mol/L NaAc和2倍体积冰冷乙醇沉淀D NA。于含EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳,85 V 60 min,紫外光下拍照记录。

  1.7 统计学方法 成组计量资料t检验,直线相关回归分析。

  2 结果

  2.1 电镜结果 显示抗U1RNP/Sm 抗体可诱导细胞凋亡,凋亡细胞核固缩,染色质聚缩,凋亡小体形成(图1)。

  2.2 瑞氏-姬姆萨染色结果 观察典型凋亡细胞,计算凋亡率,结果 见表1。

  2.3 流式细胞术(FACS)检测结果 细胞凋亡后,磷脂酰丝氨酸(PS )由细 胞膜内侧转到外侧,与annexinⅤ-FITC结合,嗜DNA荧光染料碘化丙啶(PI)只通过坏死或 破损细胞膜而不能通过完整细胞膜,结果见图2。

图1 抗U1RNP/Sm抗体诱导人淋巴细胞凋亡 的电镜照片(8 000×)

  Fig.1 Electronmicrograph of the human lymphocytes incubated

  with anti-U 1RNP /Sm antibodies(8 000×)

  Note:The cell on the left is normal, the cell on the right is a n apop totic one with cytoplasm shrinkage and nuclear condensation

表1 抗U1RNP/Sm抗体诱导人淋巴细胞凋亡

  Tab.1 Apoptosis of human lymphocytes induced by anti-U 1RNP /Sm antibody

Groups n Apoptosis(%)
A B
Anti-U1RNP antibody 8 9.95±2.151)
Anti-Sm antibody 5 15.72±3.201) 16.72±2.131)
Normal control γG 6 2.82±1.19 4.00±1.30

  note:1)vs normal control,P<0.01;A:PHA(-),B:PH A(+)

图2 FACS 结果

  Fig.2 FACS analysis of lymphocytes apoptosis

  Note:Dots in the low-right corresponds to apop totic cells, which in the example sho wn accounted for 12.78%,20.83% and 23.61% of cells incubated with (A): nor mal control γG,(B): anti-U1RNP antibody and (C):anti-Sm antibody

图3 瑞氏-姬姆萨染色法与FACS法检测细胞凋亡相 关性(n=10)

  Fig.3 Correlation between apoptosis as measured

  by Wright-Geamsa staini ng and as measured by FACS analysis (n=10)

图4 DNA电泳结果

  Fig.4 DNA fragmentation assay

  Note:lane 1.DNA isolated from cells incubated with human anti-U1RNP ant ibody;lane 2.DNA isolated from cells incubated with human anti-Sm antibody;lane 3.DNA extracted from cells cultured in the normal human γG

  2.4 瑞氏-姬姆萨染色法与FACS法的相关性 FACS与瑞氏- 姬姆萨染色 检测细胞凋亡结果的相关性见图3。两法结果的相关系数r=0.841 7,P<0.01, 成正直线相关。

  2.5 DNA电泳 可见与抗U1RNP或Sm抗体共育的淋巴细胞出现典型梯状 条带(图4)。

  3 讨论

  早期发现某些自身抗体可穿入活细胞,影响细胞功能[3,4],后又相继发现某些自 身抗体能够诱导细胞凋亡从而引发免疫功能紊乱[5-8],我们曾发现 抗钙调素自身抗体 虽可进入活的淋巴细胞但并不能诱导细胞凋亡。但有关一些重要的抗核抗体与淋巴细胞凋亡 的关系目前国内外均少见有关报道。本课题以MCTD和SLE患者体内特征性的自身抗体——抗U 1RNP /Sm 抗体为研究目标,探讨这2种自身抗体与细胞凋亡的关系。

  抗U1RNP/Sm 抗体的靶抗原RNP是细胞内功能不同的RNA分别与相应蛋白结合成的复 合体,参与mRNA转录后的剪切加工过程,RNP功能受阻会引起细胞功能改变。我们将淋巴细 胞与抗U1RNP 和抗Sm 抗体共育48 h,细胞凋亡率(9.95±2.15)%和(15.72±3.20)%与 正常对照(2.82±1.19)%相比显著升高(P<0.01)。

  抗U1RNP/Sm 抗体诱导细胞凋亡的可能机制为抗U1RNP/Sm IgG穿入活的淋 巴细胞而与细胞内、核内的靶抗原发生作用;抗U1RNP/Sm IgG结合在淋巴细胞表面 相应的靶抗原或与之有交叉反应的分子上。间接免疫荧光实验发现,抗U1RNP/Sm I gG既可结合在细胞膜上,又能进入细胞内。抗RNP抗体进入细胞的方式至今尚无一致结论, 经由 IgG的F(ab′)2、Fc部分介导及其他一些入胞方式均有报道[4,9],推 测不同亚类的IgG 对不同的细胞可能有各不相同的入胞方式。U1RNP 多肽及其异二聚体还可出现在某些淋巴 细 胞表面[10],这意味着抗U1RNP 抗体除了进入细胞与靶抗原结合直接干扰m RNA成熟外,还可结合在细胞表面,通过细胞内的信号转导途径而干扰细胞活动。抗U1RNP / Sm 抗体引起培养的人淋巴细胞凋亡,使更多的核抗原暴露于机体免疫系统,产生更多的自 身抗体[11,12],同时引起MCTD、SLE患者外周血淋巴细胞减少,结果使患者病情更 加趋于活动。结缔 组织病 (CTD)患者的淋巴细胞在体外凋亡率增加[13,14],可能是由于患者体内 淋巴细胞处于高活 化状态[15],而活化细胞比静止细胞对凋亡刺激更加敏感的原因[16] 。我们也发现PHA活化的 淋巴细胞凋亡率略有增高,推测有活化诱导的凋亡(AICD)机制参与其中。

  本研究在国内外首次阐明抗U1RNP /Sm 抗体具有诱导淋巴细胞凋亡的能力 。这一现象为进一步揭示某些自身抗体的作用机制及自身免疫病如MCTD、SLE的发病机理均 具有重要的指导意义。自身抗体诱导淋巴细胞凋亡的能力一方面对机体造成免疫损伤,另一 方面可能是机体试图限制自身免疫进程的一种自我保护机制,因而具有重要的病理和生理意义。

  作者简介:郭大文,女,29岁,第二军医大学实验诊断学专业硕士研究生;

  李晓军 指导教师,女,38岁,硕士,副主任技师;武建国 指导教师,男,64岁,主任医师,教授

  4 参考文献

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[收稿1999-03-23 二次修回1999-10-26]



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