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抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

来源:中国免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 抗人纤维蛋白单链抗体的人源化 中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 学术会议优秀论文选登 作者:李文平许静李彬蔡英林宋增璇 单位:中国协和医科大学中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津 300020 关键词:单链抗体。人源化 摘要目的:人源化抗人纤维蛋白单链抗体,降低人抗鼠抗体反......


抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 学术会议优秀论文选登

作者:李文平 许静 李彬 蔡英林 宋增璇

单位:中国协和医科大学中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津 300020

关键词:单链抗体;免疫原性;人源化

  摘 要 目的:人源化抗人纤维蛋白单链抗体,降低人抗鼠抗体反应。方法:从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体scFv-8E5重链(VH-8E5)和轻链(VL-8E5)同源性最高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入scFv-8E5的互补决定区。人工合成其DNA片段,用DNA连接酶连接成完整的人源化VH-8E5和VL-8E5,构建表达载体,转化JM109后用IPTG诱导表达,ELISA测定其抗原结合活性。结果:表达产物分子量30 kD左右,人源化scFv-8E5与亲本抗体scFv-8E5抗原结合活性无明显差别,可耐受至少2 w,4℃保存,数次反复冰融或一定时间的37℃孵育。结论:人源化scFv-8E5具有特异性识别人纤维蛋白的活性,鼠源scFv-8E5的人源化基本获得成功。

  中国图书分类号 R392.11

Humanization of anti-human fibrin single-chain antibody

LI Wen-Ping,XU Jing,LI Bin et al.

  Institute of Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300020

  Abstract Objective:In order to reduce the human anti-mouse antibody response,anti-human fibrin scFv-8E5 has been humanized.Methods:The authors have constructed a “humanized” antibody fragments by grafting the complementarity-determining regions (CDRs) of the murine anti-human fibrin scFv-8E5 to human framework regions which showed maximal homology to the scFv-8E5 sequence.The humanized VH-8E5 and VL-8E5 DNA fragments were then synthesized and ligated into the intact heavy and light variable regions respectively.The expression vectors were constructed by substituting the variable regions of scFv-8E5 with the humanized variable regions.The transformed E.coli JM109 cells were propagated and induced by IPTG.Results:Expression products were found in the total cell extracts and periplasmic space by SDS-PAGE and ELISA.It was a 30 kD single-chain fragment with human fibrin-binding specificity.The humanized scFv-8E5 showed the same fibrin-binding activity as that of the murine scFv-8E5.It could tolerate 4℃ storage for at least two weeks,freezing/thawing several times or incubation at 37℃ for a certain time.Conclusions:The humanized scFv-8E5 showed antigen-binding capacity of the parental scFv.It is useful reagents for the research of clinical use.

  Key words Single-chain antibody Immunogenicity Humanization

  危害人类健康的许多严重疾病如心肌梗塞、脑梗塞等均与血栓形成密切相关,血栓形成性疾病的发病率及死亡率均较高。抗人纤维蛋白单链抗体由免疫球蛋白重链和轻链可变区基因组成,分子量小,是抗体的最小活性单位,且组织穿透力强,体内滞留时间短、清除快,能集中针对目标组织,与放射性核素、效应分子结合可用于血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗,有很好的应用前景[1]。但是异源蛋白会引起人抗鼠抗体反应,因此对鼠源单抗的基因进行各种改造,目的在于尽量减少抗体中的鼠源成分,但保留其抗原结合特异性。

  我室克隆表达的抗人纤维蛋白单链抗体(scFv-8E5)具有特异性识别和结合人纤维蛋白β链7肽的活性[2]。本文将scFv-8E5的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)人源化,目的在于获得低免疫原性、与纤维蛋白有高结合活性的人源化抗人纤维蛋白scFv(huscFv-8E5)。

  1 材料与方法

  1.1 表达载体 表达载体pOPE101-8E5由本室构建[2],带有Lac启动子和果胶酶先导序列,表达鼠源scFv-8E5,其3’末端的C-myc短肽序列可作为表达产物的标记,6个组氨酸用于表达产物的纯化。

  1.2 人源化改造方案及其表达载体的构建 用计算机分析人免疫球蛋白数据库,寻找与VH-8E5及VL-8E5同源性高的人免疫球蛋白VH和VL序列,作为人源化改造的框架,植入scFv-8E5的CDRs,同时注意保留待改造序列中个别影响分子构象的氨基酸残基。人源化VH-8E5(huVL-8E5)分为18个DNA小片段,人源化VL-8E5(huVL-8E5)分别为12个DNA小片段,分别经DNA连接酶连接后,成为完整的huVH-8E5、huVL-8E5片段。huVH-8E5电泳纯化后用NcoI、HidnIII酶切装入同样酶切的pOPE101-8E5[2] ,轻链仍为鼠源VL-8E5,构建出表达载体pOPE-101-huVH-8E5。huVL-8E5电泳纯化后装入经MluI、BamHI酶切的pOPE101-8E5,重链仍为鼠源VH-8E5,构建出表达载体pOPE101-huVL-8E5。将pOPE101-huVH-8E5中的huVH-8E5用EcoRI、Hind III酶切装入同样酶切的pOPE101-huVL-8E5,构建出表达载体pOPE101-huscFv-8E5,此时重链和轻链均为人源化。

  1.3 序列测定 将huVH-8E5、huVL-8E5分别插入测序载体M13mp19、M13mp18,以重组M13单链DNA为模板,用4种荧光标记的M13引物(ABI公司)按ABI公司提供程序进行双脱氧末端终止反应。用ABI370A型DNA序列分析仪测序。计算机收集数据,并用ABI公司提供的DNA序列分析软件对原始数据进行分析。

  1.4 scFv的表达及纯化 选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50 μg/ml氨苄青霉素、100 mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜,次日以1∶40比例倒入新鲜LBGA,37℃振荡培养至OD600=0.7~0.9,加入终浓度20 μmol/L IPTG室温诱导,表达3 h后收集菌体,加破壁液(50 mmol/L Tris-HCl,20% Sucrose,1 mmol/L EDTA,pH8.0)冰浴1 h,30 000×g,4℃离心40 min ,收集上清液中的可溶性蛋白,经透析后用IMAC 柱一步纯化[3]。pOPE101-huVH-8E5、pOPE101-huVL-8E5、pOPE101-huscFv-8E5的表达产物分别称为huVH-scFv8E5、huVL-scFv8E5、huscFv-8E5。

  1.5 抗原结合活性的分析 用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)观察IMAC柱纯化huVH-scFv8E5、huVL-scFv8E5、huscFv-8E5与纤维蛋白的特异性识别[2]。以scFv-8E5为阳性对照,PBS代替样品为阴性对照。人纤维蛋白原(40 μg/ml)包被96孔板,37℃烤干,含20%牛血清的DMEM培养基活化纤维蛋白原成纤维蛋白,2% milk/PBS封闭,纯化的scFv为一抗,分泌抗C-myc单抗的9E10杂交瘤的腹水与scFv的C-myc位点结合,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗,四甲基联苯胺(TMB)为底物。用0.4 mol/L的硫酸终止反应后,酶标仪检测450 nm处的光吸收。

  2 结果

  2.1 DNA序列分析及推断的氨基酸序列 DNA序列分析结果表明huVH-8E5和huVL-8E5的合成和连接符合预期设想。人源DNA序列HUMHCH109、KLC400均选自Kabat database免疫球蛋白基因数据库和Tomlinson人免疫球蛋白可变区基因数据库。HUMHCH109与VH-8E5同源性73.0%,用鼠源VH-8E5的CDRs取代HUMHCH109的相应CDRs,但保留影响表达产物三维结构的少数几个氨基酸(图1-A)。人源、鼠源免疫球蛋白第46位氨基酸多为Gly,Arg46少见。当氨基酸残基位于CDR区域附近5 nm以内时,一般参与CDR构象的形成[4]。因此靠近CDR2的Ile50、Lys69、Ala70均保留原鼠源氨基酸残基。鼠源VH-8E5 FRs中共改变了20个氨基酸,huVH-8E5为122个氨基酸。KLC400与VL-8E5同源性76.3%,用鼠源VH-8E5的CDRs取代KLC400的相应CDRs(图1-B),骨架氨基酸全部为人源序列。鼠源VL-8E5 FRs中共改变了19个氨基酸,人源化VL-8E5为113个氨基酸。

图1 huVH-8E5(A)、huVL-8E5(B)推断的氨基酸序列

  Fig.1 Deduced amino acid sequences of the humanized anti-fibrin scFv-8E5 heavy chain(A) and light chain(B)

  Note:The amino acid sequences of the human antibody heavy and light chains (upper lines) are shown aligned above the mouse anti-fibrin heavy and light chains sequences(lower lines),with a“∶”indicating identity of amino acids.The three CDRs in each chain are underlined,and the other mouse amino acids used in the humanized scFv are double underlined

  2.2 huVH-scFv8E5、huVL-scFv8E5、huscFv-8E5的表达 100 μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE 电泳表明,pOPE101-huVH-8E5、pOPE101-huVL-8E5、pOPE101-huscFv-8E5这3种重组子的表达产物相对分子量约30 kD左右,与scFv-8E5相近。从20 μmol/L

  IPTG诱导组的周质腔提取可溶性scFv,经IMAC柱一步纯化后scFv纯度达90%以上[3]

  2.3 huVH-scFv8E5、huVL-scFv8E5、huscFv-8E5对纤维蛋白识别 多批表达产物不同浓度的重复检测结果标明,存在于周质腔可溶性蛋白组分的huVH-scFv8E5、huVL-scFv8E5、huscFv-8E5均有结合人纤维蛋白的功能。人源化VH及VL对scFv-8E5的抗原结合活性无明显影响,huscFv-8E5与亲本抗体鼠源scFv-8E5的抗原结合活性相似(图2)。

图2 人源化scFv-8E5的抗原结合活性分析

  Fig.2 Fibrin-binding analysis of humanzied scFv-8E5

图3 人源化scFv-8E5的稳定性

  Fig.3 The stability of huscFv-8E5

  Note:RT room temperature

  2.4 huscFv-8E5的稳定性 ELISA检测经IMAC柱一步纯化后scFv与人纤维蛋白的结合,所用蛋白浓度为100 μg/ml,以新提取scFv为阳性对照,阴性对照用PBS代替scFv。结果表明huscFv-8E5同鼠源scFv-8E5一样有较高的稳定性,冻融1~3次、4℃保存1~2 w或37℃孵育1 h后其与纤维蛋白的结合活性无明显变化,37℃孵育2 h活性约下降1/3,室温放置1 w后有部分活性,见图3。样品中加入0.02%的叠氮钠,防止细菌生长。

  3 讨论

  抗人纤维蛋白scFv-8E5能特异性地结合人纤维蛋白,因而在血栓的定位诊断和导向治疗中有很好的应用前景。但鼠源性单抗用于临床治疗的最大障碍是其高免疫原性。为了降低鼠单抗的异源性,可用基因工程技术将鼠单抗人源化。CDR移植抗体采用人免疫球蛋白可变区框架,添入决定抗原结合特异性的CDRs,用这种方法改造的抗体免疫原性低,又可保留甚至提高其抗原结合力。为了保证改造后的抗体分子仍有类似改造前的分子构象,在选择人免疫球蛋白可变区框架时,应尽可能挑选与待改造序列同源性高的人源序列,同时注意保留待改造序列中个别影响分子构象的氨基酸残基,紧靠CDRs的氨基酸一般不宜改动[5]。本项研究设计遵守上述原则,获得较好的结果,scFv-8E5的人源化改造基本上获得了成功。

  scFv本身不会引起全抗的生物学效应,但可以利用其抗原结合特异性把其它效应分子带到靶位[6]。人源化的抗人纤维蛋白scFv可以标记上放射性核素,定位诊断深部血栓;亦可以将溶栓剂导向血栓,增强了溶栓剂的特异性,减少毒副作用,产生高效、安全等作用,有很好的应用前景。人源化scFv-8E5很稳定,反复冻融及短期4℃保存后对其抗原结合活性影响不大,说明人源化scFv-8E5稳定性好,容易保存,又可耐受一定时间的体温,失活前有充分的时间与血栓结合,是作临床前研究的有用材料。

  作者简介:李文平,女,29岁,博士研究生;

  宋增璇,女,63岁,博士生导师,主要研究造血调控

  参考文献

  1 Bode C,Hanson S R,Schmedtje J J et al. Antithrombotic potency of hirudin is increased in nonhuman primate by fibrin targeting.Circulation,1997;95:800

  2 Song Z X,Cai Y L,Song D Y et al.Primary structure and functional expression of heavy-and light-chain variable region genes of a monoclonal antibody specific for human fibrin .Hybridoma,1997;16(3):235

  3 Dübel S,Breitling F,Klewinghaus I et al.Regulated secretion and purification of recombinant antibodies in E.coli.Cell Biophys,1992;21:69

  4 Roguska M A,Pedersen J T,Henry A H et al.A comparison of two murine monoclonal antibodies humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing.Protein Engineering,1996;9:895

  5 Gorman S D,Clark M R,Routledge E G et al.Reshaping a therapeutic CD4 anti-body.Proc Natl Acad Sci USA,1992;88:4181

  6 Neri D,Natali P G,Petrul H et al. Recombinant anti-human melanoma antibodies are versatile molecules.J Invest Dermatol,1996;107:164

收稿1998-12-12 修回1999-06-08



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