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磷脂抗体阳性红斑狼疮患者周围血T细胞受体基因表达初探①

来源:中国免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 磷脂抗体阳性红斑狼疮患者周围血T细胞受体基因表达初探① 中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 临床免疫学 作者:王元沈南薛峰裴军陈顺乐 单位:上海第二医科大学附属仁济医院风湿病科,上海200001 关键词:TCR-Vβ。SLE。DQA1 摘要目的:初步探讨SLE患者周围血T细胞受体Vβ基因是否存在偏移。方法:应用荧......


磷脂抗体阳性红斑狼疮患者周围血T细胞受体基因表达初探①

中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 临床免疫学

作者:王元 沈南 薛峰 裴军 陈顺乐

单位:上海第二医科大学附属仁济医院风湿病科,上海200001

关键词:TCR-Vβ;SLE;抗磷脂抗体(APL);HLA-DRB1;DQA1

  摘 要 目的:初步探讨SLE患者周围血T细胞受体Vβ基因是否存在偏移。方法:应用荧光PCR定量方法对HLA-DRB1*0803/DQA1*0103的抗磷脂抗体阳性SLE患者4例,病人对照干燥综合征(SS)1例,正常对照3例进行周围血TCR-Vβ的分析。结果:健康者和病人对照的TCR仅少数Vβ(<5个Vβ基因)有轻微增高表达。1例非活动性SLE患者与对照组相仿,但3例活动性SLE的TCR-Vβ基因谱呈多克隆激活,其中2例有15~17个Vβ基因呈中度以至高度表达,甚至Vβ/Cα高达100.5%(Vβ4/Cα)和208.8%(Vβ2/Cα)。3例活动性SLE的Vβ7、Vβ12、Vβ22都呈现异常增高表达,与正常对照有显著差异(P<0.05~0.01)。结论:选择性的TCR-Vβ基因的优势表达可能对SLE的发病和活动起极大的作用。

  中国图书分类号 R593.24

A primary study on TCR-Vβ usage of peripheral blood lymphocyte patients with positive antiphospholipid antibody of systemic lupus erythematosus

WANG Yuan,SHEN Nan,XUE Feng et al.

  Department of Rheumatology Ren Ji Hospital Affiliated to Shanghai No.2 Medical University,Shanghai 200001

  Abstract Objective: The preliminary inguirng into probable divergence TCR-Vβ usage of peripheral blood lymphocytes in patients with SLE. Methods: 4 patients with SLE, 1 patient control with SS, according to the Amenican college of rheumatology criteria, 3 normal controls were analyzed for T cell Vβ repertoire using fluorecent quantity PCR technique, all cases with positive antiphospholipid antibody and HLA-DRB1*0803/DQA1*0103. Results: The three healthy and one patient (SS) controls showed faint expression in only one to five Vβ families respectively. The patient with non active SLE showed a similar result to the controls, while the other three, who had active disease, showed marked polyclonal activity in their T cell Vβ repertoire, 2 of 3 affecting more than 15 of the 23 Vβ families analyzed. Some Vβ expression was very high even Vβ4/Cα and Vβ 2/Cα with 100.5% and 208.8% respectively. 3 cases of active SLE showed marked abnormal expression of TCR with Vβ7, Vβ12, Vβ22. There were significant different between patients with active SLE and controls in TCR Vβ/Cα(P<0.05~0.01). Conclusion: Dominont expression of selective TCR-Vβ would play an important role in pathogenesis and disease activation of SLE.

  Key words TCR-Vβ SLE APL HLA-DRB1 DQA1

  系统性红斑狼疮(SLE)是累及多系统的典型自身免疫病之一。其发病机理至今不清。患者血清中诸多自身抗体的产生,T细胞所参与的免疫应答是机体整个免疫调节的核心。近来不断有用T细胞受体(TCR)谱研究自身免疫性疾病报道,如多发性硬化症(MS)[1],自身免疫脑脊髓膜炎(EAE)[2,3],自身免疫性甲状腺炎[4],重症肌无力(MG)[5]等。在这些自身免疫病中,其TCR特定成分的有限性取用有明显的偏移。但对SLE患者的T细胞受体谱的研究甚少。免疫应答三分子复合体即“抗原-T细胞-MHC”,T细胞受体的行为严格受主要组织相溶性复合体(MHC)II类抗原的限制。本文选择具有阳性抗磷脂抗体,HLA-DRB1*0803/DQA1*0103的系统性红斑狼疮患者,探索其TCRβ基因可变区(TCR-Vβ)是否存在偏移。

  1 材料与方法

  1.1 病例 本院风湿病科患者和正常对照,均为HLA-DRB1*0803/DQA1*0103。其中SLE患者4例,活动期SLE 3例(2例女性,1例男性),非活动期SLE 1例(女性),平均年龄42.05±10.4岁。病人对照1例,为干燥综合征(SS),女性30岁。正常对照3例,均为女性,平均年龄48.30±12.6岁。

  1.2 实验方法

  1.2.1 周围血淋巴细胞的收集 取静脉血10 ml肝素抗凝,密度梯度离心法分离单个核细胞。

  1.2.2 总RNA的抽提 应用QIAGEN RNeasy Total RNA kit。

  1.2.3 逆转录cDNA 应用CLONTECH 1st-strand cDNA synthesis kit。

  1.2.4 荧光标记引物,PCR扩增TCR-Vβ家族基因 5′端 Vβ引物: 应用CLONTECH T cell Receptor Typing Amplimer kits。 Vβ1~Vβ25,5′-Cα为内参照引物;3′端引物: 6-FAM 荧光标记引物3′-Cβ,3′-Cα的合成,6-FAM 购自ABI公司,荧光标记引物由中科院细胞所合成。PCR扩增: PCR反应仪, PE公司DNA Thermal cycler 480。

  PCR条件:5′-Vβ,3′-Vβ,5′-Cα,3′-Cα均1 μl (25 μmol/L);cDNA 2.5~4.0 μl(RNA浓度为0.100~0.272 μg/ml);10×PCR缓冲液2.5 ml,MgCl2 2 μl(25 mmol/L); dNTPmix 1 μl(10 mmol/L GILBCO 公司); Taq 酶 0.5 μl ( Promega Taq DNA polymarase, 5 U/μl)加DEPC处理的蒸馏水到总反应体积25 μl,小心加入20 μl石腊油,于薄壁管(Gene Amp),95℃,1 min,55℃ ,1 min,72℃,1 min,32个循环,最后72℃ 延伸7 min,PCR产物避光置4℃保存。

  1.2.5 琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物 1.5%琼脂糖凝胶,0.5 μg/ml溴乙锭,0.5×TBE 缓冲液,电泳30 min,用紫外光凝胶图像分析仪(UVP公司)初步鉴定PCR产物Vβ和Cα。

  1.2.6 373 DNA SEQUENCER GENE SCAN荧光标记定量PCR方法分析Vβ家族基因  凝胶制备: 6%聚丙烯酰胺凝胶,1×TBE缓冲液(GILBCO BRL)。电泳: Vβ1/Cα~Vβ25/Cα样品1.5 ~2.0 μl 加入各胶孔,用琼脂糖载样缓冲液(APPLIED BIOSYSTEMS)对倍稀释。电压500 V,电泳2 h。分析: 用GENE SCAN 软件包分析,Vβ峰面积除以内参照Cα峰面积。结果表示:Vβ/Cα×100%。

  1.2.7 统计分析 SLE患者Vβ/Cα与正常对照Vβ/Cα以团体比较t检验予以统计分析。

  2 结果

  2.1 UVP显示的Vβ、Cα 为180~370碱基对(bp)的Vβ和604 bp的Cα呈现清晰的两条带。

  2.2 373 DNA SEQUENCER GENE SCAN显示的Vβ和内参照Cα 见图1。

  2.3 GENE SCAN显示的Vβ1~Vβ25/Cα 见图2。

  2.4 373 DNA SEQUENCER GENE SCAN荧光标记定量PCR法的考核 敏感性: 0.3 pmol。重复性: 同一例Vβ1~Vβ24/Cα样品,24个样品经3次373 DNA SEQUENCER GENE SCAN分析其批间差异S=(S2+SW2/r)1/2=6.15。

图1 373 DNA SEQUENCER GEND SCAN 显示的Vβ和内参照Cα

  Fig.1 Vβ and internal control Cα showed by 373 DNA SEQUENCER GEND SCAN

图2 GEND SCAN 显示的Vβ1/Cα~Vβ25/Cα

  Fig.2 Vβ1/Cα~Vβ25/Cα showed by GEND SCAN

  2.5 正常对照和病人对照组的TCR-Vβ家族基因 3例正常对照和1例SS病人对照仅1至5类Vβ/Cα有轻度增高,正常对照组Vβ1~Vβ24/Cα的平均值约为5%~27%。1例SS患者有4类Vβ/Cα较正常对照升高,约16.4%~50.9%。

  2.6 磷脂抗体阳性的SLE患者TCR-Vβ家族基因 4例SLE患者中一例为非活动期,仅显示2至4类Vβ/Cα轻度升高,为3%~34%,与正常和病人对照相仿。3例为活动期SLE,其中两例有15~17类Vβ/Cα中度以至高度表达,一例活动性发作的男性SLE患者 (发热,面部蝶形红斑,关节痛,蛋白尿,血沉95 mm/h),有的Vβ/Cα高达100.5%(Vβ4/Cα),甚至208.8%(Vβ2/Cα)。由此显示活动性SLE患者的TCR-Vβ基因谱呈现多克隆激活。

  2.7 磷脂抗体阳性SLE患者TCR-Vβ基因谱的偏移 3例活动期SLE患者都有Vβ7、Vβ12、Vβ22异常表达,其Vβ/Cα均数分别为(58.1±24.1)%,与正常对照比较,P<0.01,(24.8±10.5)%,P<0.05,(39.1±31.0)%,P<0.05。 而1例非活动期SLE患者则分别为14.5%、12 .7%、17.3%。 正常对照分别为(18.9±8.7)%、(11.2±3.5)%、(7.9±2.3)%; 一例SS患者分别为4.4%、6.1%、7.4%。

  3 讨论

  由于九十年代PCR分子生物学技术的广泛应用,使TCR基因的研究得以进行,由于373 DNA SEQUENCER GENE SCAN荧光标记PCR定量分析方法的出现,使TCR 基因的研究跳出了放射性同位素标记的桎梏,能大批量地进行PCR定量分析。避免了放射性同位素的环境污染,而且荧光定量PCR分析方法敏感性高,重复性好,一次可作数十个PCR产物的定量分析,3 h后,即可得到精确的实验结果,包括图像、数据分析等。至今尚未见到应用该方法的报道。

  系统性红斑狼疮的发病机理十分复杂,为要在有限的实验中尽可能发现一些现象,本文在数千例SLE患者中选一亚型,其血清中都含有阳性抗磷脂抗体,且 HLA Ⅱ类抗原为DRB1*0803/DQA1*0103,在免疫应答的三分子复合体调节核心中,在HLA分子对TCR基因的调节上作了限定,以观察TCR-Vβ基因的表达。

  本文初步结果显示,正常人对照和自身免疫病对照干燥综合征患者以及非活动SLE患者周围血TCR-Vβ基因仅1至5类Vβ基因的表达呈轻度增高,而活动性SLE患者周围血TCR-Vβ基因呈多克隆激活,有15~17类Vβ基因呈异常高度表达,该结果与Holbrook 等报道的相仿[6]。Holbrook 等人用放射性同位素标记法的结果显示,2例健康对照和3例SLE患者仅显示2~3类Vβ基因的表达增高,而一活动性SLE患者周围血TCR-Vβ基因有17类表达显著增高。这些实验的结果提示,多克隆的T细胞激活与疾病的活动相关。

  本文的实验结果显示3例活动期SLE患者中都呈现Vβ7、Vβ12和Vβ22 基因的增高表达,其中一例虽然仅有4类V基因呈中度增高表达,但仍持续数月呈疾病活动状态 (面部红斑,关节酸痛)。本文结果提示,TCR-Vβ7、Vβ12、Vβ22基因的激活可能与疾病的活动有关。而Furnkawa 等人报道[7],他们用免疫组化方法检测盘状狼疮患者(DiscoidLE,DLE)皮损中浸润的淋巴细胞和周围血单个核细胞(PBMC)的TCR-Vβ基因,结果显示DLE(系慢性皮肤型狼疮 Chronic cutaneous LE,CCLE)与急性皮肤型狼疮(Acutecutaneous LE,ACLE,其中60%为SLE)相比较,TCR Vβ 8.1和Vβ 13.3呈高度表达,而DLE和ACLE患者的Vβ 3.1均显著降低。本文结果与Furnkawa 的结果显示, SLE 和DLE的TCR-Vβ基因都有各自的选择性表达,也就是有其各自的TCR-Vβ基因谱的偏移。这些结果提示SLE和DLE的发病机理中,可能与不同的抗原(包括超抗原)驱动有关。

  综上所述,选择性的TCR-Vβ基因的优势表达可能对于SLE的发病、活动以及缓解都起着极大作用。

  资金项目:本课题由上海市科委自然科学基金资助,项目编号 94ZB14016

  作者简介:王 元,女,49岁,副教授,硕士生导师,主要研究SLE发病机理;

  沈 南,男,35岁,硕士,副教授,主要研究SLE发病机理

  参考文献

  1 Musette P,Bequet D,Delarbre C et al. Expansion of a recurrent V beta 5.3+ T-cell population in newly diagnosed and untreated HLA-DR2 multiple sclerosis patients. Proc Natl Acad Sci USA, 1996;29(93): 12461

  2 Whitham R H,Wingett D,Wineman J et al. Treatment of relapsing autoimmune encephalomyelitis with T cell receptor V beta-specific antibodies when proteolipid protein is the autoantigen. J Neurosci Res ,1996;15 (45):104

  3 McCombe P A,Nickson I,Tabi Z et al. Apoptosis of V beta 8.2+ T lym- phocytes in the spinal cord during recovery from experimental auto-immune encephalo-myelitis induced in Lewis rats by inoculation with myelin basic protein. J Neurol Sci, 1996; 139(1): 1

  4 McMurray R W,Hoffman R W,Tang H et al. T cell receptor V beta usage in murine experimental autoimmune thyroidites. Cell Immunol, 1996;25 (172):1

  5 Kraig E,Pierce J L, Klarkin K Z et al. Restricted T cell receptor repertoire for acetylcholine receptor in murine myasthenia gravis. J Neuroimmunol, 1996;71(1~2): 87

  6 Holbrook M R,Tighe P J, Powell R J et al. Restrictions of T cell receptor beta chain repertoire in the operipheral blood of patients with systemic lupus erythematosus. ANN Rheum Dis, 1996; 55(9): 627

  7 Furnkawa F,Tokura Y, Matsushita K et al. Selective expansions of T cell expressing V beta 8 and V beta 13 in skin lesions of patients with chronic cutaneous lupus erythematosus. J Dermatol, 1996; 23(10): 670

收稿1997-08-25 修回1998-06-01



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