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一种可同时检测抗双链和单链DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验

来源:中国免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 一种可同时检测抗双链和单链DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验 中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 免疫学技术与方法 作者:兰小鹏涂向东黄俏佳冯修高唐玉钗朱忠勇周明宣①陈学香① 单位:兰小鹏涂向东黄俏佳冯修高唐玉钗朱忠勇周明宣①陈学香①(南京军区福州总医院全军医学检验中心,福州350001) 关键词:抗......


一种可同时检测抗双链和单链DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验

中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 免疫学技术与方法

作者:兰小鹏 涂向东 黄俏佳 冯修高 唐玉钗 朱忠勇 周明宣① 陈学香①

单位:兰小鹏 涂向东 黄俏佳 冯修高 唐玉钗 朱忠勇 周明宣① 陈学香①(南京军区福州总医院全军医学检验中心,福州350001)

关键词:抗双链DNA抗体;抗单链DNA抗体;斑点免疫金渗滤试验

  摘 要 目的:建立一种可同时检测抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)。方法:将ds-DNA和ss-DNA抗原结合在同一检测盒内,采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术,同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体。结果:DIGFA既可同步又可区别检测两种DNA抗体,且检测ds-DNA抗体的敏感性优于酶联免疫吸附法(ELISA)。结论:DIGFA简便、快速、可靠,是一种实用的DNA抗体检测方法。

  中国图书分类号 R446.62

A rapid dot immunogold filtration assay for the simultaneous detection of ds-DNA and ss-DNA antibodies

LAN Xiao-Peng,TU Xiang-Dong,HUANG Qiao-Jia et al.

  Medical Laboratory Centre,Fuzhou General Hospital,Fuzhou 350001

  Abstract Objective:To develope a rapid dot immunogold filtration assay(DIGFA)for the simultaneous detection of antidouble stranded DNA (ds-DNA) and single-stranded DNA(ss-DNA) antibodies.Methods:ds-DNA and ss-DNA antigens being incorporated in a sam test kit, a novel DIGFA for the simultaneous detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies was established.Results:The test showed that the DIGFA could not only distinguish anti-ds-DNA from anti-ss-DNA antibodies but also simplify the procedure of the detection.The DIGFA was more sensitive and specific than enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA).Conclusion:The DIGFA described was rapid,simple and repreducible and was a practical assay for the detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies.

  Key words Anti-ds-DNA antibodies Anti-ss-DNA antibodies Dot immunogold filtration assay

  DNA抗体可分为抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)两种,前者一般仅见于全身性红斑狼疮(SLE),具有较高的特异性;后者可见于多种自身免疫性疾病,特异性较低。二者结合起来,有助于SLE和多种自身免疫病的诊断及鉴别诊断。本研究将ds-DNA和ss-DNA组合在同一个检测盒内,采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术,建立了一种可同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold filtration assay,DIGFA)。

  1 材料与方法

  1.1 主要试剂和材料 含质粒pBR322的大肠杆菌(福建医学院包幼迪教授惠赠)。MagicTM DNA纯化系统(Promega产品)。卵亲和素、光敏生物素(军事医学科学院产品)。小牛胸腺DNA(CT.DNA,华美产品)。葡萄球菌蛋白A(SPA,上海生物制品研究所产品)。牛血清白蛋白(BSA,德国Boehringer产品)。硝酸纤维素膜(NC 0.45 μm,黄岩生化材料厂产品)。抗ds-DNA和ss-DNA抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海二医大科技服务部)。

  1.2 血清标本 确诊的SLE病人50例;混合结缔组织病(MCTD)10例;类风湿性关节炎(RA)15例;硬皮病(PSS)12例;干燥综合征(SS)8例;多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)14例;慢性肝病(CLD)20例;正常人200例,常规取静脉血,分离血清。

  1.3 ds-DNA的提取及生物素标记 见文献[1,2]。

  1.4 ss-DNA的制备 取CT.DNA 10 ml、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中,在4℃连续搅拌24 h,待完全溶解后,置100℃水浴10 min,再迅速转移至冰浴中冷却,放4℃备用。

  1.5 ds-DNA和ss-DNA抗原膜的制备 ds-DNA抗原点的制备见文献[2]。在膜的另一处用ss-DNA(50 μg/ml)直接点样。在ds-DNA和ss-DNA两点之间,包被一杠状的人IgG(100 μg/ml),2%BSA封闭。

  1.6 抗ds-DNA和ss-DNA抗体检测盒的制备 参见文献[3]。

  1.7 胶体金标记SPA的制备 参见文献[4]。

  1.8 DIGFA检测方法 见文献[3]。结果判断:反应孔内出现一红色杠和两个斑点:抗ds-DNA阳性或抗ds-DNA和ss-DNA均为阳性;出现一红色杠和一个斑点:单项抗ss-DNA阳性;只出现红色杠:抗ds-DNA 和ss-DNA均为阴性;无任何显示为检测无效。

  1.9 ELISA法测抗ds-DNA和ss-DNA抗体 按试剂盒的操作说明书进行。

  2 结果

  2.1 中和试验 ds-DNA和ss-DNA抗体均阳性及单项ss-DNA抗体阳性的血清分别加入ds-DNA和ss-DNA,在37℃中和1 h,加3%聚乙二醇,离心沉淀,上清液再用DIGFA检测,结果两种抗体均阳性的血清用ds-DNA中和后,ds-DNA抗体变为阴性,ss-DNA抗体仍为阳性,而用ss-DNA中和后则二者均变为阴性。单项ss-DNA抗体阳性的血清只能被ss-DNA中和。

  2.2 稳定性和重复性试验 检测盒分置4℃和室温保存,每隔1 w检测同一份抗ds-DNA和ss-DNA阳性的血清,结果4℃存放一年、室温半年,其结果均未改变。取强阳性和弱阳性血清各5份,分别重复测定5次,每次相隔1 w,测定结果也相同。

  2.3 临床应用 用DIGFA检测了329份血清,结果见表1,在79例非SLE的自身免疫病人中,ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性的仅1例(1.2%),ss-DNA抗体单项阳性17例(21.5%);可见ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性一般仅见于SLE,而单项ss-DNA抗体阳性可见于非SLE的自身免疫病及少数正常人。

  2.4 方法比较 各组血清标本同时用DIGFA和ELISA进行测定,结果见表1。DIGFA检测ds-DNANote:the digit in table indicated the positive number and positive rate(in brace)抗体的阳性率高于ELISA(经配对计数资料的t检验,P<0.05),DIGFA的特异性也优于ELISA。

表1 DIGFA和ELISA检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体结果

  Tab.1 The result of detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies by DIGFA and ELISA

Group n DIGFA ELISA
Anti-ds-DNA

  and anti-ss-DNA

 Anti-ss-DNA Anti-ds-DNA  Anti-ss-DNA
SLE 50 31(62.0) 6(12.0) 27(54.0) 32(64.0)
MCTD 10 1(10.0) 2(20.0) 1(10.0) 3(30.0)
RA 15 0 4(26.6) 2(13.3) 5(33.3)
PSS 12 0 3(25.0) 1(8.3) 4(33.3)
SS 8 0 2(25.0) 1(12.5) 2(25.0)
PM/DM 14 0 4(28.6) 2(14.3) 5(35.7)
CLD 20 0 2(10.0) 1(5.0) 2(10.0)
Normal 200 0 8(4.0) 5(2.5) 11(5.5)

  3 讨论  文献表明抗ds-DNA与ss-DNA抗体有交叉反应,即ds-DNA抗体不仅可以与ds-DNA结合,还可以与ss-DNA结合,但ss-DNA抗体只能与ss-DNA结合[5,6]。结果显示当ds-DNA抗体阳性的时候,其ss-DNA抗体必然阳性,但ss-DNA抗体阳性时,ds-DNA抗体不一定阳性;ds-DNA抗体既可被ds-DNA又可被ss-DNA抑制,而ss-DNA抗体只能被ss-DNA所抑制,结果证实了两种抗体的交叉反应性。由于DNA是一种特殊的抗原分子,因此这种交叉反应机理还不完全清楚,可能是因为抗ds-DNA抗体的特异性不仅与ds-DNA分子中的碱基序列,而且与ds-DNA分子的空间构像有关。而抗ss-DNA抗体可能主要是针对碱基的。在高度螺旋化的ds-DNA分子中,疏水碱基位于分子中心,只暴露在距离不到1 nm的DNA分子双螺旋化所形成的沟槽内,因此单纯针对碱基的抗体无法进入这种又窄又深的沟槽,不能与之结合。我们曾报道用纯化的细菌质粒ds-DNA作为抗原来检测ds-DNA抗体[2,3]。考虑到原有的单纯以ss-DNA作为抗原来检测ss-DNA抗体的方法并不是检测真正意义上的抗ss-DNA抗体,而是包括了能与ss-DNA交叉反应的抗ds-DNA抗体,因此为了区别这两种抗体并简化其检测方法,我们在原有工作的基础上将ss-DNA和ds-DNA结合在同一检测盒内NC膜的不同位点上,同时检测ds-DNA和ss-DNA抗体,使原来需要分别检测的两个项目合二为一,在2 min内一次操作即可完成。结果显示,DIGFA不仅简便、快速,而且敏感性高、特异性强、方法稳定,是一种实用的DNA抗体检测方法。

  ①福州总医院内科,福州350001

  作者简介:兰小鹏,男,博士生,副主任技师,主要从事自身免疫和自身抗体方面的研究;

  朱忠勇,男,主任技师,教授,硕士生导师,主要从事血液遗传等方面的研究

  4 参考文献

  [1] 徐 洵,刘震乾编.DNA重组技术.北京:科学出版社,1989:274-275

  [2] 兰小鹏,朱忠勇.一种新的检测抗双链DNA抗体的斑点免疫结合试验.中华医学检验杂志,1995;17(3):133

  [3] 兰小鹏,黄俏佳,叶小芬 et al.用快速斑点免疫金渗滤法检测抗双链DNA抗体.中华医学检验杂志,1996;19(2):92

  [4] Slot J W.A new method of preparing gold probes for multiple labelling cytochemistry.Eur J Cell Biol,1985;38:87

  [5] Emlen W,Jarusiripipat P,burdick G.A new ELISA for the detection of double-stranded DNA antibodies.J Immunol Methods,1990;132:91

  [6] 兰小鹏.抗双链DNA抗体研究的若干进展.国外医学*免疫学分册,1994;17(6):304

〔收稿1997-09-05 修回1998-05-06〕



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