当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 临床医学与专科论文 > 检验医学 > 人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能

人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:李文平… 2009-2-21
336*280 ads

摘要: 【 摘要 】目的探索人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能。方法构建人源化抗人纤维蛋白单链抗体(ScFv-8E5)基因与链亲和素基因的重组表达载体,制备融合蛋白,ELISA观察其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白的反应。结果人源化融合蛋白可特异性识别人、大鼠、豚鼠纤维蛋白,同时有生物素的结合位点,且......


【 摘要 】 目的 探索人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能。方法 构建人源化抗人纤维蛋白单链抗体(ScFv-8E5)基因与链亲和素基因的重组表达载体,制备融合蛋白,ELISA观察其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白的反应。结果 人源化融合蛋白可特异性识别人、大鼠、豚鼠纤维蛋白,同时有生物素的结合位点,且稳定性好,可耐受至少两周4℃保存,数次反复冻融或一定时间的37℃孵育。结论 此人源化融合蛋白适用于大鼠及豚鼠血栓病模型,是作临床前研究的有用材料。

Expression and function of humanized anti-human fibrin single chain antibody-core-streptavidin fusion protein

LI Wenping, XU Jing, SUI Jianhua, et al.

  (National Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, P. R. China)

  【 Abstract 】 Objective To express and characterize humanized anti-human fibrin single chain antibody-core-streptavidin fusion protein.Methods The humanized anti-human fibrin single-chain antibody-core-streptavidin fusion protein was constructed by inserting a sequence encoding core-streptavidin at the 3′ end of the humanized ScFv-8E5 structural gene. ELISA was used in analysis of its antigen binding ability.Results The fusion protein was stable, capable of binding to human, rat and guinea pig fibrin, but not to their fibrinogen and bovine albumin.Conclusion Humanized anti-fibrin singe-chain antibody-core-streptavidin fusion protein could be useful in future study on thrombus imaging and also thrombolytic agents targeting.

  【 Subject words 】 Anti-fibrin; Humanization; Fusion protein; Streptavidin

  血栓形成与危害人类健康的许多严重疾病密切相关,发病率及死亡率均较高。抗人纤维蛋白单链抗体与放射性核素或溶栓效应分子结合〔1〕可用于血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗,有很好的应用前景。Rosebrough等〔2〕用抗人纤维蛋白单抗与链亲和素交联,产生的融合蛋白用放射性核素标记的生物素作两步法血栓显影获得良好的效果,与传统显影方法相比具有显影本底低、特异性强的优点。本文作者制备了人源化抗人纤维蛋白单链抗体(huScFv-8E5)与核心链亲和素(Core-streptavidin)融合蛋白,对其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白结合实验进行了研究,以寻找适合此融合蛋白体内血栓显影的动物模型,目的在于获得结构稳定、特异性强的血栓显影剂。

  材料与方法

  表达载体的构建:我室克隆表达的抗人纤维蛋白单链抗体(ScFv-8E5)具有特异性结合人纤维蛋白的活性〔3〕。对ScFv-8E5的VH〔4〕、VL进行了人源化改造,获得的人源化huScFv-8E5与鼠源ScFv-8E5的抗原结合活性无明显差别〔5〕。构建huScFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-huScFv-8E5(图1),带有Lac启动子和果胶酶先导序列,在IPTG的诱导下表达,其3′末端的6个组氨酸用于表达产物的纯化。

  人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白(huScFv::core-streptavidin)的表达和纯化:选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50μg/ml氨苄青霉素、100mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜,次日1∶40倒入新鲜LBGA,37℃振荡培养至A600=0.7~0.9,加入终浓度100μmol/L IPTG室温诱导,表达3 h后收集菌体,超声破碎细胞收集包涵体,用含3mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl、pH7.0的溶液洗涤后加入6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCl、pH7.0溶液溶解,经固相金属离子亲和层析(IMAC)一步纯化〔5〕。用TEA 缓冲液(0.4mol/L L-精氨酸-HCl,0.1mol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,pH7.0)透析复性后,Amicon YM 10 membranes浓缩。

  图1 重组的表达载体pSTE2-huScFv-8E5

  Fig 1. Restriction map of the recombinant expression vector pSTE2-huScFv-8E5

  SDS-PAGE:100μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白及纯化蛋白用10%聚丙烯酰胺还原电泳,考马斯亮蓝染色后观察。

  huScFv::core-streptavidin融合蛋白与纤维蛋白的特异性结合:用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)〔3〕观察IMAC柱纯化的huScFv::core-streptavidin与各种纤维蛋白的结合。用各种纤维蛋白原(40μg/ml)分别包被96孔板,37℃烤干,用含20%牛血清的DMEM培养基活化纤维蛋白原成纤维蛋白,2% milk/PBS封闭后加入不同稀释度的样品,用PBS代替样品作阴性对照。加入1∶150生物素标记的辣根过氧化物酶(Biotin-HRP)检测结合的融合蛋白,四甲基联苯胺(TMB)为底物。用0.4mol/L的硫酸终止反应后,酶标仪检测450nm处的光吸收度。

  纤维蛋白原对huScFv::core-streptavidin抗原结合活性的竞争性抑制:纤维蛋白原包被、活化、封闭后,每孔加入50μg/ml抗凝血酶Ⅲ(anti-thrombinⅢ,ATⅢ) 100μl,37℃,15 min。倾去ATⅢ,加入不同稀释度的融合蛋白(预先与终浓度200μg/ml的纤维蛋白原37℃孵育30 min),用PBS代替样品作阴性对照。Biotin-HRP检测结合的融合蛋白,TMB为底物。硫酸终止反应后,酶标仪检测450nm处的光吸收度。

  结果

  1.huScFv::core-streptavidin的表达、纯化:100μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE表明,huScFv::core-streptavidin融合蛋白单体相对分子质量(Mr)约43×103左右,见图2。

  图2 总蛋白的SDS-PAGE

  Fig 2. SDS-PAGE of total cell extracts

  M: Protein molecular weight markers

  Lane 1. E.coli JM109 transformed with pSTE2-huScFv::core-streptavidin without iPTG; Lane 2. E.coli JM109 transformed with pSTE2-huScFv::core-streptavidin with 100μmol/L iPTG; Lane 3. Purified fusion protein of pSTE2-huSvFv::core-streptavidin

  2.huScFv::core-streptavidin与纤维蛋白的结合活性:ELISA检测结果表明,IMAC柱纯化后的融合蛋白可与人、大鼠、豚鼠的纤维蛋白结合,而不与小牛血清白蛋白结合,见图3。

  图3 huSvFv-8E5::core-streptavidin融合蛋白与人及不同动物纤维蛋白的结合

  Fig 3. The binding ability of huSvFv-8E5::core-streptavidin with human and other animal fibrin

  3.纤维蛋白原对huScFv::core-streptavidin抗原结合活性的竞争性抑制:人源化融合蛋白与人、大鼠、豚鼠的纤维蛋白原预先孵育后,并未降低融合蛋白与它们各自纤维蛋白的结合活性,见图4、5、6,表明此融合蛋白的特异性好,与纤维蛋白原无结合。

  图4 人纤维蛋白原对huSvFv-8E5::core-streptavidin抗原结合活性的抑制

  Fig 4. Competition of huSvFv-8E5::core-streptavidin with human fibrinogen

  图5 大鼠纤维蛋白原对huScFv-8E5::core-streptavidin抗原结合活性的抑制

  Fig 5. Competition of huScFv-8E5::core-streptavidin with rat fibrinogen  4.huScFv::core-streptavidin的稳定性:ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与人纤维蛋白的结合,以新鲜制备的融合蛋白为阳性对照,阴性对照用PBS代替融合蛋白,所用蛋白浓度为112.5μg/ml。huScFv-8E5::core-streptavidin活性稳定,可耐受至少2周4℃保存,数次反复冻融或一定时间的37℃孵育,室温放置1周后有部分活性,见图7。样品中加入0.02%的叠氮钠,防止细菌生长。

  图6 豚鼠纤维蛋白原对huScFv-8E5::core-streptavidin抗原结合活性的抑制

  Fig 6. Competition of huScFv-8E5::core-streptavidin with guinea pig fibrinogen

  图7 ScFv-8E5::core-streptavidin 的稳定性

  Fig 7. The stability of ScFv-8E5::core-streptavidin

  A: 37℃ 1 h; B: 37℃ 2 h; C: Freeza and milt 1 time; D: Freeza and milt 2 times; E: Freeza and milt 3 times; F: RT 1 week; G: RT 2 weeks; H: 4℃ 1 week; I: 4℃ 2 weeks

  讨论

  链亲和素(streptavidin)由4个相同的Mr约15×103亚单位构成,天然配基是生物素(biotin),链亲和素单体间的聚合可以使融合蛋白形成四聚体结构〔5〕,有助于提高抗原结合力。去除链亲和素的N-和C-末端几个氨基酸后形成的核心链亲和素仍不失其生物素结合活性〔6〕。我们构建表达的人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白具有结合纤维蛋白和生物素双重功能,有利于核标记的生物素示踪此融合蛋白在体内的分布。

  Rosebrough等〔2〕为了降低同位素直接标记单抗显影剂的本底,用链亲和素与抗人纤维蛋白单抗交联,注射后再给同位素标记的生物素,结果证明这种两步法显影效果好。用基因重组技术构建和表达huScFv8E5::core-streptavidin融合蛋白,比用化学方法制备融合蛋白产品稳定,大批量生产时成本较低,是制备两步法血栓显影剂的新探索。为了在动物体内进行血栓显影和抗血栓研究,我们观察了huScFv

  8E5::core-streptavidin与不同动物纤维蛋白的反应,发现它能与大鼠、豚鼠的纤维蛋白结合,而不与它们各自的纤维蛋白原结合,抗原特异性好,体内应用不会引起出血等副作用,适用于大鼠、豚鼠血栓病模型。huScFv8E5::core-streptavidin结构稳定,容易保存,反复冻融及短期4℃保存后对其抗原结合活性影响不大,又可耐受一定时间的体温,失活前充分的时间与血栓结合,是作临床前研究的有用材料。

  参考文献

  1,Bode C, Hanson SR, Schmedtje JF Jr, et al. Antithrombotic potency of hirudin is increased in nonhuman primate by fibrin targeting. Circulation, 1997, 95:800-804.

  2,Rosebrough SF, Hashmi M. Galactose-modified streptavidin-GC4 antifibrin monoclonal antibody conjugates-application for two-step thrombus/embolus imaging. J Pharmacol Exp Ther, 1996, 276:770-775.

  3,Song ZX, Cai YL, Song DY, et al. Primary structure and functional expression of heavy and light-chain variable region genes of a monolonal antibody specific for human fibrin. Hybridoma, 1997, 16:235-241.

  4,李文平,蔡英林,许静,等.抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化.中华微生物学和免疫学杂志,1999,19(3):246-249.

  5,李文平,许静,李彬,等.抗人纤维蛋白单链抗体的人源化.中国免疫学杂志,1999,15:569-571.

  6,Dubel S, Breitling F, Kontermann R, et al. Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single chain antibodies(ScFv). J Immunol Meth, 1995, 178:201-209.



医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: