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蓝舌病毒两外壳蛋白VP2和VP5在昆虫细胞中的表达及其特性

来源:中华实验和临床病毒学杂志 作者:王健伟… 2009-2-21
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摘要: 【摘要】目的研究蓝舌病毒(BTV)VP2与VP5的免疫学特性,为BTV基因工程疫苗研究和病毒样颗粒装配打下基础。方法将BTV10 VP2和VP5基因分别插入杆状病毒表达载体pFastBac1,转染昆虫细胞获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blot检测重组杆状病毒对VP2和VP5的表达,运用组织培养中和试验和直接血凝试验检测表达产物的生物......


【摘要】 目的 研究蓝舌病毒(BTV)VP2与VP5的免疫学特性,为BTV基因工程疫苗研究和病毒样颗粒装配打下基础。方法 将BTV10 VP2和VP5基因分别插入杆状病毒表达载体pFastBac1,转染昆虫细胞获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blot检测重组杆状病毒对VP2和VP5的表达,运用组织培养中和试验和直接血凝试验检测表达产物的生物学活性。结果 重组杆状病毒分别对BTV10 VP2与VP5蛋白进行了表达,表达的VP2蛋白具有诱导中和抗体的活性和血凝活性,其免疫小鼠血清对BTV10的中和抗体滴度为1∶64,对BTV1有部分中和活性(1∶16),对BTV13无任何中和作用。VP5蛋白不具血凝活性和诱导中和抗体的能力,但两者联合免疫小鼠产生的中和抗体滴度要高于VP2单独免疫者(1∶256)。结论 昆虫细胞中表达的VP2能诱导中和抗体并具有血凝活性,VP5可增强VP2诱导中和抗体的能力,可用于病毒样颗粒的装配和基因工程疫苗研究。

Expression and characterization of two outer capsid proteins VP2 and VP5 of bluetongue virus in insect cells

WANG Jianwei, JIANG Huiying, QU Jianguo, et al.

  Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

  【Abstract】 Objective To study the biological characteristics of the outer capsid proteins VP2 and VP5 of bluetongue virus (BTV) expressed in insect cells and their potential use in the assembly of BTV and genetic engineering vaccine.Methods The genes which encode the two outer capsid proteins VP2 and VP5 of bluetongue virus (BTV) 10 were separately cloned into pFastBac1 vector and the corresponding recombinant baculoviruses were obtained.Results BTV VP2 could be expressed in Sf-9 cells better than VP5. Further works indicated that VP2 could elicit neutralizing antibodies to BTV10(1∶64), and also could partially neutralize BTV1(1∶16), but could not neutralize BTV13. The co-immunizing of VP2 and VP5 could induce higher neutralizing antibodies to BTV10 and BTV1. VP2 also showed a hemagglutination activity.Conclusion VP2 expressed in insect cells could induce neutralizing antibodies to BTV and had the biological activity of hemagglutination, VP5 could enhance the ability of neutralizing antibody induction of VP2, they can be used for the assembly of virus-like particles and for the development of genetic engineering vaccine.

  【Key words】  Bluetongue virus  Viral proteins  Gene, expression  Baculoviridae

  蓝舌病毒(Bluetongue virus, BTV)是呼肠孤病毒科环形病毒属的原型病毒,其基因组由10个双链RNA节段组成,编码10(11)个蛋白,与VP1、VP4和VP6一道组成病毒的核心,其外部包绕着核心主要蛋白VP3和VP7,VP2与VP5组成病毒壳蛋白的外层。VP2为型特异性的决定原。根据VP2的差异可将BTV分为24个血清型[1]。VP2还可以诱导中和抗体并具有血凝活性[2,3],在病毒致病过程中具有十分重要的地位。因此,对其进行研究以阐明病毒的致病机制、发现针对该病毒的免疫保护途径,从而为研制新一代疫苗服务均具有十分重要的作用。另一方面,BTV的研究结果对于研究与其同属一科的轮状病毒的免疫机制可能也会有所启示。本文利用杆状病毒系统成功表达了BTV10的两个外壳蛋白VP2和VP5,对其免疫学特性进行了初步探讨。

  1 材料和方法

  1.1 细菌与质粒 pAcBL2与pAcBM5分别含有BTV10 L2和M5基因,由病毒学研究所形态研究室保存。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统购自LTI公司。

  1.2 病毒与血清 抗BTV10 VP5、VP2兔免疫血清以及BTV1、BTV10、BTV13由美国尤他州立大学Joseph KK Li教授惠赠,表达BTV13 VP7的重组杆状病毒的构建见文献[4],野生型杆状病毒AcNPV由形态研究室保存。

  1.3 细胞与实验动物 草地贪夜蛾细胞(Sf-9)和幼地鼠肾细胞(BHK-21)均由形态研究室保存。4~6周龄雌性Balb/C小鼠购自中国药品生物制品检定所动物繁育场。

  1.4 重组杆状病毒的获得与表达产物提取 分别构建表达VP2、VP5的杆状病毒表达载体,经过转座作用提取Bacmid转染Sf-9细胞,分别获得表达VP2、VP5的重组杆状病毒,具体方法参见试剂盒说明。以MOI 5~10分别用两种重组病毒或两种病毒混合感染Sf-9细胞,72 h后收获细胞,用PBS洗涤1次,悬于1/20培养体积的裂解液[10 mmol/L Tris-HCl(pH7.4), 150 mmol/L NaCl],置冰浴中,超声破碎,高速离心收集上清,分装-80℃冻存备用。

  1.5 动物免疫 用上述裂解液0.1 ml与等量完全弗氏佐剂混匀,腹腔注射Balb/C小鼠。2周后同量与不完全弗氏佐剂混匀重复腹腔注射,此后2周每周同量注射1次,只是不加任何佐剂。第6周眼眶无菌采血,收集血清。试验分为VP2、VP5、VP2+VP5、VP7四组,每组5~10只小鼠。

  1.6 组织培养中和试验 先在组织培养上分别测定BTV1、BTV10与BTV13的TCID50。方法为先用10 ml小试管培养BHK21细胞,细胞加入量为100 ml培养瓶的1/10,培养体积为1 ml,病毒自10-4开始稀释,稀释至10-8,每一稀释度平行培养5管。进行中和试验时,弃培养上清,以200 TCID50的病毒量(用MEM稀释)与等量的倍比稀释的小鼠抗血清(0.2 ml)混合,加入细胞管中,37℃吸附1 h,弃之,换维持液继续培养,每一稀释度作5管,72 h后观察细胞病变情况并进行有关计算,共进行2次试验,以最低值为准进行统计。

  1.7 血凝试验 采用正常兔血红细胞,具体方法参见文献[5]。

  2 结果

  2.1 重组杆状病毒表达载体的构建 用BamHⅠ分别将L2与M5基因从pAcBL2和pAcBM5上切下,用低熔点琼脂糖回收,分别与已经用BamHⅠ切开的pFastBac1载体连接,转化DH5α宿主菌,提取质粒经酶切鉴定,获得正向插入克隆,分别命名为pFB1BL2和pFB1BM5。图1A、B分别为重组表达载体pFB1BL2和pFB1BM5的质粒结构。

  2.2 BTV10 VP2和VP5蛋白在昆虫细胞中的表达 用重组杆状病毒DNA(Bacmid)转染Sf-9细胞后72 h收获转染上清,转接Sf-9细胞扩增病毒,取上清负染后电镜观察可见到杆状病毒的存在,说明转染成功。将所获病毒分别命名为rvBacBTVP2和rvBacBTVP5。分别用重组病毒感染昆虫细胞,72 h收获细胞进行SDS-PAGE检测,可见rvBacBTVP2在野生型BTV10 VP2/VP3对应位置出现约100 000的特异性表达带(见图版Ⅰ,图A),表达量最高可达细胞蛋白总量的10%左右;VP5没有见到可分辨的表达带(因其预测相对分子质量为59 000,而此位置细胞本底蛋白带较强)。Western blot检测结果表明,两种蛋白均得到正确表达,大小与预测相对分子质量一致(图2;图版Ⅰ,图B)。

  2.3 VP2蛋白具有诱导中和抗体的活性 用VP2、VP5、VP2+VP5、VP7分别免疫Balb/C小鼠, 制备免疫血清,分别与BTV1、BTV10、BTV13病毒反应,测定其中和抗体滴度。结果表明,昆虫细胞表达的BTV10 VP2可诱导中和抗体,此抗体主要中和BTV10(1∶64),可部分中和BTV1(1∶16),对BTV13没有中和作用(<1∶4)。若用VP2-VP5联合免疫则可增强这种作用(中和抗体滴度最低为1∶256),VP5本身和VP7均不能诱导中和抗体。图3为中和抗体的测定结果。

图A Sf-9细胞中BTV10VP2表达的SDS-PAGE检测结果

  1:BTV10病毒颗粒;2:rvBacBTVP2; 3:阴性对照;4:野生型杆状病毒;5:蛋白分子量标准

  图B Sf-9细胞中BTV10VP5表达的Western blot检测

  1:阴性对照;2:野生型杆状病毒;3:rvBacBTVP5;4:BTV10病毒颗粒

  Fig.A SDS-PAGE delection of BTV10 VP2 expressed in Sf-9 cells

  1:BTV10 virions. 2:rvBacBTVP2. 3:Mock. 4:Wild type AcNPV. 5:Protein marker

  Fig.B Western blot of BTV10 VP5 expressed in Sf-9 cells

  1:Mock. 2:Wild type AcNPV. 3:rvBacBTVP5. 4:BTV10 virions

图1 重组杆状病毒表达载体的结构

  Fig.1 Structures of the recombinant baculovirus expression vectors

图2 Sf-9细胞中BTVP2的表达Western blot检测

  Fig.2 Western blot of Bac VP2 expressed in Sf-9 cells1:rvBacBTVP2. 2:Wild type AcNPV

图3 不同抗原诱导的中和抗体滴度

  Fig.3 Neutralizing antibodies in mouse sera

  induced by different antigens

  2.4 VP2蛋白的血凝活性 用昆虫细胞表达的VP2、VP5、VP7和野生型AcNPV分别进行直接血凝试验,证明重组VP2与野生型蓝舌病毒一样,具有血凝活性,滴度最低可达1∶160,而VP5、VP7和AcNPV均无此活性(血凝滴度<1∶4)(图4)。

图4 不同抗原的血凝活性

  Fig.4 Comparison of hemagglutination activity

  among different antigens

  3 讨论

  为了探讨BTV VP2与VP5的免疫学特性,我们用杆状病毒系统对其进行表达并对表达产物的特性进行了初步研究。以往的研究表明,VP2蛋白是蓝舌病毒编码蛋白中唯一能激发中和抗体的蛋白,也是唯一的血凝蛋白[2,3]。我们的结果表明,表达VP2具有血凝活性和诱导主要针对同型病毒的中和抗体的活性,VP5可以增强VP2诱导中和抗体的能力,这说明在Sf-9细胞中表达的VP2、VP5均具有生物学活性。

  VP2蛋白的氨基酸序列具有高度可变性,其中含有型特异性抗原表位,据此可将蓝舌病毒分为不同的血清型,各血清型间氨基酸的同源性绝大部分在50%以下[2,3,6-8],这可能是VP2诱导的中和抗体不能中和所有型别病毒的原因。我们的实验结果证实,BTV10 VP2激发的中和抗体对BTV10有很好的中和作用,而对在氨基酸序列上与其同源性极低的BTV13没有任何中和活性,对BTV1有部分中和作用,这些结果与理论预期是相符的。因此,要研制针对复杂多变的BTV疫苗,首先要考虑当地流行毒株的VP2血清型,只有选择针对流行血清型的BTV基因研制疫苗才有可能得到理想的保护效果。这种思路对于同属呼肠孤病毒、而又同样复杂多变的轮状病毒疫苗的研制或许有所启示。

  在表达VP5的过程中我们发现,VP5重组病毒感染细胞后24 h即出现细胞崩解,且随着时间的延长,细胞崩解死亡的数目在不断增多,提示VP5蛋白可能对Sf-9细胞有一定毒性,这种毒性可能会对VP5的表达造成不良影响。除了结构功能,VP5蛋白的其它功能目前还不清楚。我们的结果表明,VP5可增强VP2的中和活性,其机理目前还不清楚。从VP2的中和表位分析结果来看,已知的表位均可能是构相依赖型的,因为尽管不同型间某些部位的氨基酸序列不同,而在这些区域的表位有些是相似的[8,9]。因此我们推测,VP5与VP2一道免疫动物能更好地激发中和抗体,可能与其参与维持VP2中和表位的构相有关。根据VP5氨基酸顺序推测其内部含有糖基化位点[10],我们用Western blot检测仅在59 000处发现一条表达带,与其预测相对分子质量大小一致,表明在昆虫细胞中表达的VP5是不经糖基化修饰的。

  BTV VP2、VP5蛋白位于病毒粒子的最外层,二者紧密结合形成病毒的外壳蛋白层,对于组成完整的病毒粒子外壳二者缺一不可。我们利用杆状病毒表达系统对BTV VP2和VP5蛋白进行了有效表达,这也为我们下一步研究蓝舌病毒样颗粒的装配准备了条件。

  作者单位:100052 北京,中国预防医学科学院病毒学研究所

  参考文献

  1 Roy P. Toward the control of emerging bluetongue disease. London: Oxford Virology Publications, 1991.

  2 Kahlon J, Sugiyama K, Roy P. Molecular basis of bluetongue virus neutralization. J Virol,1983,48:627-632.

  3 Cowley J A, Gorman BM. Genetic reassortants for identification of the genome segment coding for the bluetongue virus hemagglutinin. J Virol,1987,61:2304-2306.

  4 王健伟,姜慧英,李晓成,等.在昆虫细胞中高效表达蓝舌病毒VP7蛋白作为组特异性诊断抗原.病毒学报,1999, 15: 238-243.

  5 黄桢祥,主编.医学病毒学基础及实验技术.北京:科学出版社,1990.第149-164页.

  6 Mertens PPC, Pedley S, Cowley J, et al. Analysis of the roles of bluetongue virus outer capsid proteins VP2 and VP5 in determination of virus serotype. Virology,1989,170:561-565.

  7 Huismans H, Erasmus BJ. Identification of the serotype-specific and group-specific antigens of bluetongue virus. Onderstepoort J Vet Res, 1981, 48:51-58.

  8 Yamakawa M, Krasnyck V, Roy P. Phylogenetic relationships of the VP2 protein of a virulent isolate of bluetongue virus (BTV23) compared to those of 6 other BTV serotypes. Virus Res, 1994,34:81-92.

  9 Pierce CM, Rossitto PV, MacLachlan NJ. Homotypic and heterotypic neutralization determinants of bluetongue viurs serotype 17. Virology,1995,209:263-267.

  10 Yang KK, Li JK. Glycosylation of the major outer capsid protein of bluetongue virus. Virology, 1993,194:350-354.



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