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丙型肝炎病毒蛋白酶生物学功能研究进展

来源:中华实验和临床病毒学杂志 作者:范涛陶… 2009-2-21
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摘要: 丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒,基因组含一大开放读码框架,其编码的多蛋白前体经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工成具有生物学功能的成熟蛋白。研究表明,病毒编码的蛋白酶-Zn2+依赖性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶与HCV非结构区的加工有密切关系。本文就这两种病毒蛋白酶结构、生物学功能、底物特异性......


丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒,基因组含一大开放读码框架,其编码的多蛋白前体经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工成具有生物学功能的成熟蛋白。研究表明,病毒编码的蛋白酶-Zn2+依赖性金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶与HCV非结构区的加工有密切关系。本文就这两种病毒蛋白酶结构、生物学功能、底物特异性及酶活性影响因素等作一综述。

  HCV是输血后和许多社区获得性非甲非乙肝炎的主要致病因子。感染HCV后,可表现为无症状携带状态,急性肝炎,慢性肝炎,肝坏死和肝硬化,并与肝细胞癌有密切关系。同源性比较和疏水性分布图谱分析表明,HCV与黄病毒科的黄病毒、瘟疫病毒具有高度的同源性,目前已将其归为黄病毒科第三个独立的属-HCV属。该科病毒有许多共同的属性:均具有脂质包膜,单股正链RNA基因组,相似的基因结构,一个大开放读码框架(ORF),编码3000~4000个氨基酸残基的多蛋白前体,其N端为结构蛋白,C端为非结构蛋白,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切割加工成多个成熟蛋白质。比较研究表明,HCV除具备一些共同的特点外,还有许多独特的性质。本文就HCV病毒蛋白酶生物学功能做一综述。

  1 HCV多蛋白前体加工概况

  HCV为单股正链RNA病毒,其基因组长约9.5Kb,5′端和3′端各有一个长345bp和约60bp的非编码区,编码区含一个大开放读码框架,编码3 010~3 033氨基酸残基的多蛋白前体,经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶在翻译同时或翻译后加工成具有生物学功能的成熟蛋白[1]

  多蛋白前体的加工至少有三条途径,并产生10种以上的成熟蛋白质,其排列顺序为NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH,C-E2-E2-p7为结构蛋白,C/E1、E1/E2、E2/p7、p7/NS2位点的裂解由位于内质网(ER, endoplasmic reticulun)的宿主信号肽酶催化。C为核心蛋白,长191氨基酶,富含碱性氨基酸,序列高度保守,免疫原性强,N端有多个线性B细胞表位,C端有一疏水区,作为E1转位至ER膜的信号,并为C区膜依赖性加工所必需[2]。p7功能尚不清楚。E1、E2为包膜蛋白,分别含有5或6和11个N-型糖基化位点,C/E1、E1/E2、NS2/NS3位点的裂解是在翻译的同时进行的,E2/p7和p7/NS2在翻译后进行,并产生二个E2前体蛋白,E2-NS2和E2-p7,虽然E2-p7在HCV-1和HCV-H株相对稳定,而在HCV-BK的研究表明,E2/p7位点的加工更为有效,E1E2可能通过非共价键和共价二硫键结合两种方式相互作用折叠形成异源二聚体,作为病毒的功能亚单位,其形成速度依赖于ER中的“分子伴侣”(molecular chaporene)存在[3]

  病毒前体蛋白的加工,在许多病毒需要由病毒基因组编码的多个蛋白酶共同完成。HCV的另外两条途径就是由病毒编码的蛋白酶-1和蛋白酶-2(分别命名为Cpro-1和Cpro-2)介导的。Cpro-1为Zn2+依赖性金属蛋白酶,Cpro-2为丝氨酸蛋白酶,有关Cpro-1和Cpro-2生物学功能将在下文详述。

  由于患者血清中低水平的病毒颗粒以及缺乏有效的HCV细胞培养繁殖体系,阻碍了对病毒蛋白加工的直接分析,病毒蛋白质的加工及其生物学性质的研究受到一定限制,目前主要通过应用兔网织红细胞裂解物体外无细胞翻译系统以及在哺乳动物细胞中由质粒介导的瞬时表达,痘苗病毒介导的基因转移,及杆状病毒载体系统等手段进行研究[4]。由于研究体系的差异及所用病毒株的不同,各家报道的HCV各蛋白连接位点及蛋白质分子量也有所不同。Major ME等总结几家实验室对HCV基因组和多蛋白产物的研究结果,有一定的代表性(见表1)[5]

表1 HCV基因组和多蛋白产物特征

基因/蛋

  白质

核苷酸位置* 成熟蛋白质

  氨基酸位置

大致分子量

  (SDS-PAGE)

功能
5’UTR 1-341   起始翻译,复制
C 342-857 1-191/179/182 p21/p19 结构(基因/蛋白质),包裹病毒RNAξ
E1 915-1490 192-383 gp31 结构,受体结合,细胞穿入ξ
E2 1491-2579 384-746 gp70 结构,受体结合,细胞穿入ξ
E2-p7 1491-2568 384-809 gp70 未知:可能为前体或结构
p7 2580-2768 747-809 p7 未知
NS2 2769-3419 810-1026 p21 NS2-3蛋白酶组分
NS3 3420-5312 1027-1657 p70 NS2-3蛋白酶组分、丝氨酸蛋白酶、螺旋酶、NTP酶
NS4A 5313-5476 1658-1711 p6 NS3丝氨酸蛋白酶辅助因子
NS4B 5477-6257 1712-1972 p27 复制酶成分ξ
NS5A 6258-7600 1973-2420 p58 复制酶成分ξ
NS5B 7601-9374 2421-3011 p68 RNA依赖性RNA多聚酶
3’UTR 9375-9621   复制。ξ病毒基因组的包装ξ

  * 根据HCV-H株核苷酸和氨基酸序列确定

   5′UTR包含数个短的读码框架;是否有多肽产物或其功能尚不清楚

  ◆ N-型糖基化蛋白质分子量

  ξ 根据与其他病毒的比较推测的功能

  2 Zn2+依赖性金属蛋白酶(Cpro-1)

  虽然大多数的位点可由宿主信号肽酶或丝氨酸蛋白酶催化裂解,但NS2/3位点的裂解似由另一病毒编码的蛋白酶催化,就在Cpro-2证实不久,大量资料表明Cpro-1的存在。对E2/NS1、NS2及NS3末端氨基酸序列分析表明,NS2位于氨基酸序列810~1026位,其分子量为21Kd,Cpro-1位于NS2和NS3N端1/3区,与Cpro-2部分重叠。黄病毒和瘟疫病毒都没有Cpro-1相应的基因组位置、切割位点特异性及酶活性特征的报道,这也是HCV区别于这两种病毒的特征之一。用Ala替换His-952或Cys-993可灭活酶活性,其他位置包括Cpro-2活性中心的替换突变对Cpro-1活性没有影响,突变灭活Cpro-1也不阻碍Cpro-2依赖性位点的切割,表明Cpro-1和Cpro-2是互不依赖的两个相互独立的病毒蛋白酶[6]。Cpro-1切割位点为1026-1027,该位点周围的氨基酸序列在已知的HCV不同基因型的分离株相对保守,其序列为Trp-Arg-Leu-Leu-(1026)↓-Ala(1027)-Pro-Ile-Thr。但突变实验表明Cpro-1无固定的底物特异序列,而为某些优选序列(preference sequence),其切割位点容许某些氨基酸替换。NS2/3位点的切割不需要微粒体膜,但微粒体的存在可增强切割效率和/或稳定切割产物[7]

  应用脉冲追踪试验对HCV体外翻译产物进行分析,观察蛋白酶抑制剂对Cpro-1活性的抑制效果,EDTA强烈抑制Cpro-1活性,当反应体系中加入Zn2+可恢复酶的活性[8]。另一报道也显示,Zn2+不仅可以恢复EDTA所抑制的酶的活性,而且可以增强酶活性,在实验体系中可将酶活性增强达基础水平3倍以上。在体系中加入ZnCl2或MgCl2可解除EDTA对Cpro-1酶活性的抑制,但只有ZnCl2能增强酶活性,MgCl2无增强作用,其它二价阳离子Ni2+和Co2+对Cpro-1活性没有显著影响[4]。这些研究提示,Cpro-1为Zn2+依赖性金属蛋白酶。与其它已知的金属蛋白酶序列进行比较,Cpro-1区域内未发现与之相似的序列基元。几乎所有的金属蛋白酶和金属肽链内切酶都有共同的Zn2+结合氨基酸,在这些酶内,His和Gln为已知的Zn2+协同子(coordinator),Cys为某些金属蛋白酶和金属结合蛋白催化功能所必需,对Zn2+结合氨基酸配体残基的突变可导致蛋白酶活性的缺失和相应的未加工前体的聚集。考虑到Cpro-1可能通过某些氨基酸如Cys、His或Gln与Zn2+相互作用,因此,通过突变方法确定Cpro-1与Zn2+起协同作用的氨基酸残基,将上述氨基酸用Ala或其它氨基酸替换,在952位氨基酸和993位氨基酸的替换酶活性完全丧失,其它替换对酶活性没有影响。因此952位氨基酸和993位氨基酸对酶的活性甚为重要,可能为Cpro-1的Zn2+协同子[8]。这些氨基酸均位于NS2区,而NS3区N端为Cpro-1裂解NS2/3所必需,NS3的作用可能表现在以下方面:1、酶活性位于NS2区,NS3有助于酶或NS2/3切割位点的正确折叠,2、二者均为Cpro-1组成成分,共同构成酶活性中心,这样,NS2/3位点将位于酶内,NS2/3的裂解将导致酶活性的丧失。这种情况与新培斯病毒(sindbis virus)糜蛋白酶“自杀性”酶灭活机制相仿,该酶位于新培斯病毒核心蛋白C端,核心蛋白通过蛋白酶裂解从前体蛋白释放出来,其切割位点即位于蛋白酶本身的底物结合区[9]

  如上所述,虽然Cpro-1和Cpro-2序列部分重叠,但二者活性功能是完全互不依赖的,突变导致Cpro-1失活对Cpro-2依赖性切割位点没有影响,然而这种观点正受到挑战,一些报告显示,NS2预先切割与否与下游部分的酶切加工有很大关系,下游序列的一些位点的裂解依赖NS2蛋白的预先切除,未切除的NS2序列严重阻碍Cpro-2介导的下游序列的多蛋白的酶切,因此,NS2/3的有效切割在HCV复制中起关键作用。这些结果的差异是由于基因型抑或表达体系的不同所致尚需探讨[10]

  Cpro-1以何种方式介导切割尚无定论,E2-p7-NS2前体的迅速形成、不存在NS2/3中间体表明NS2/3位点的加工运行着某种快速切割机制,提示其作用方式为分子内顺式(intramolecular reaction, cis)切割行为。但在某些特定条件下,酶切可由分子间的反式(intermolecular, trans)方式进行,在一系列共转染实验中发现NS2/3位点可以trans方式切割,如果后一点得以证实,那么对于纯化Cpro-1研究其性质、进行底物特异性研究及筛选有效的蛋白酶抑制剂将大有裨益[6、7、8]

  3 丝氨酸蛋白酶(Cpro-2)

  3.1 Cpro-2结构和功能

  NS3为多结构域蛋白质,其分子量70KDa。根据NS3区保守序列同源性的比较预测,该区内包括丝氨酸蛋白酶,NTP酶和RNA螺旋酶的序列基元(motif),这些酶的活性和功能已在体外实验得以证实[11、12]。将HCV-H株与黄病毒科的某些成员如日本脑炎病毒、登革热病毒1~4型、壁虱脑炎病毒等进行序列对准分析,发现这些病毒都有一个丝氨酸蛋白酶催化中心基序(HDS),该基序在HCV-H株中位于His-1083,Asp-1107,Ser-1165[13]。定点突变法以Ala替换His1083或Ser1165完全阻断下游成熟蛋白的产生,而生成一个分子量约215KDa的NS3-5B的多蛋白前体,以ALa替换Cys1078和Ser1164对这些位点的加工没有影响,表明His1083、Ser1165为催化中心的重要组成部分,进一步研究表明,该基序内任一氨基酸的替换,Cpro-2即丧失对下游位点的酶切活性[14]。在大肠杆菌细胞、杆状病毒转染的昆虫细胞及哺乳动物细胞内均观察到Cpro-2活性及其特异的切割活性。组成Cpro-2催化中心的氨基酸位于NS3 N端1/3区内,目前已报道的应用NS3 C端不同长度缺失的突变体,维持酶活性的最小范围可限定在N端181氨基酸以内(1027~1207)[15]

  Cpro-2对NS3-5各位点的切割方式不同。Bartenschlager R等应用重组痘苗病毒对HCV非结构蛋白的前体的加工动力学及其机制进行了研究,他们构建起始于NS2 C端20个氨基酸终止于NS5B终止密码子(氨基酸1007~3011)的重组表达载体,以区域特异性抗血清免疫沉淀法及分子量大小鉴定HCV特异蛋白和切割产物及其中间体,结果Cpro-2可有效地裂解NS3′-NS5B位点,以Ala替代Ser则失去切割活性,以蛋白酶活性缺失的NS3′-5B突变体重组痘苗病毒和有Cpro-2活性的重组痘苗病毒共同感染Hela细胞,获得NS4A/4B、NS4/5A、NS5A/5B位点裂解产物,说明这些位点的裂解可以trans方式介导,在这种方式下NS3/4A裂解却不能完成,并且该位点的裂解对Cpro-2酶稀释不敏感,提示NS3/4A以Cis方式进行。酶动力学研究显示NS3/4A、NS5A/5B裂解发生迅速,NS4A/NS4B、NS4B/5A相对缓慢[16]

  HCV非结构蛋白的加工不需要微粒体膜成分的参与,但微粒体成分不同程度地增加某些位点的切割效率。在无细胞体外翻译系统和质粒介导的哺乳动物细胞瞬时表达体系均观察到加工效率的差异。在体外翻译体系中,存在微粒体膜时非结构蛋白可离心分为游离和膜结合二种形式,NS2主要分布于膜成分上,NS3有游离和膜结合二种形式,NS4A则可与游离或膜结合的NS3共沉淀,二种形式的NS3可不同程度地与NS4B、NS5A、NS5B共沉淀。无论是游离还是膜结合形式,大部分非结构蛋白之间都有密切关系。当体外同时翻译NS2、NS3、NS4A时,NS3主要为膜结合形式,而仅同时表达NS2、NS3时,NS3则以游离形式存在。膜成分可能通过锚定某些蛋白质促进蛋白质之间以复合体形式相互作用[4]

  虽然α-IFN在部分患者可抑制HCV复制,但其疗效并不令人满意,总的来说,目前尚缺乏控制和清除HCV感染的可靠的治疗药物。随着对病毒蛋白酶结构和功能的认识,以病毒蛋白酶为靶点的药物设计和药物疗效的研究已逐渐成为抗HCV药物发展的重要策略之一。一些实验室已表达和纯化Cpro-2,建立了不同体系来观察酶活性的影响因素和酶抑制剂的效果。Mori等构建Cpro-2功能区的重组表达载体,在E.coli中表达并纯化Cpro-2,以NS5区的NS5A/NS5B为底物,观察某些商品化蛋白酶抑制剂对酶切效果的影响,发现广谱蛋白酶抑制剂PMSF、TLCK、TPCK、Pefabloc/sc、3,4-dichloroiscoumarin有效地抑制蛋白酶活性,螯合剂如EDTA、CyDTA、1,10-phenanthroline对酶活性也有抑制效果;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+对Cpro-2都无激活作用,Zn2+、Ni2+即使在很低的浓度对酶活性也表现为抑制效果,金属离子不能解除EDTA对酶的抑制,在无金属离子存在时将EDTA稀释,酶活性可完全恢复,这是不同于Cpro-1的重要特征,同时也表明EDTA等螯合剂通过其他机制如与蛋白酶直接结合而产生作用[17]

  3.2 底物特异性

  Cpro-2的切割方式、切割效率与被切割的多蛋白底物的特异性有很大关系。对许多HCV分离株Cpro-2切割位点侧翼氨基酸残基序列的比较表明,一个共同序列与Cpro-2底物特异性有关,这个序列为Asp-Glu-x-x-x-x-Cys/Thr-Ser/Ala,Asp/Glu位于P6位,Cys/Thr位于P1位,Ser/Ala位于P1′位,x可位任一氨基酸[18](根据Berger和Schechter命名法,肽链被切割后产生的C端第一个氨基酸位P1,往前依次位P2、P3等,产生的N端第一个氨基酸为P1′,往后依次类推[19])。

  构建重组痘苗病毒在COS细胞内表达NS3′-5B,并对P1、P1′、P6处氨基酸进行突变分析,结果在所有Cpro-2依赖的切割位点中,P1替换对切割效率的影响最剧,提示该处的氨基酸是最为重要的底物决定因素。P1′的替换则影响相对较小,P6外酸性氨基酸的一系列替换对切割效率无甚影响。对多株NS3/4A位点的突变分析表明P6的替换具有很大的灵活性,而其它trans切割位点底物的特异性则相对严格,因此Leinbach SS等认为Cis加工主要由多蛋白折叠所决定,trans切割则不仅由多蛋白结构而且由Cpro-2与切割部位附近的多蛋白的底物特异性相互作用所决定[18]。分别以合成多肽片段和重组蛋白为底物切割效率有所差异,以各位点的一系列合成十肽为底物,其切割效率依次为NS5A/5B>NS4A/4B》 NS4B/5A[20]。然而,在培养细胞中,以完整的NS区,其效率为NS3/4A=NS5A/5B NS4B/5A》 NS4B/5A>NS4A/4B[21,22],表明在以合成多肽或纯化的蛋白质为底物与体内应用的完整多蛋白底物Cpro-2酶动力学存在差异。虽然HCV不同型或亚型之间氨基酸一级结构之间有很大的差异,但以HCV-H株(1a)的蛋白酶对HCV-BK株(1b)底物或以HCV-BK株蛋白酶对HCV-H株底物均表现出完整的酶切活性,提 示不同的型及亚型之间蛋白酶和底物相互作用在遗传进化上的相对保守和稳定性[15]

  应用X射线晶体衍射法已经对已知的丝氨酸蛋白酶三维结构已进行深入的研究,其活性中心由His、Asp/Ser组成,在所有已知结构的丝氨酸蛋白酶中,催化中心的氨基酸残基的相对空间位置在三维结构中十分保守。Pizzi等在分析其它已知的丝氨酸蛋白酶分子结构和各种HCV分离株的保守序列的基础上提出了Cpro-2与底物结合的“袋”状分子模型,这种结构提示P1位理想的氨基酸为Cys或Ser等具有短侧链的疏水性氨基酸。以具有大的疏水性侧链或芳香族侧链氨酸替换P1处的氨基酸极大降低突变位点的切割效率,而且以极性氨基酸(Asn)或小的疏水性氨基酸(Ala)也降低或阻碍对trans切割位点的切割,与袋状结构一致[23]。HCV NS3蛋白酶结构域的结构知识,特别是其底物结合“袋”的几何立体构型,对预测酶的特异性以及设计以结构为基础的用于治疗HCV感染的蛋白酶抑制剂都极为有用。

  3.3 NS4A与Cpro-2活性的关系

  NS3 Cpro-2介导非结构蛋白NS3-NS5B的加工,但仅有NS3是不够的,酶活性的发挥,需要NS4A的辅助。缺失NS4A,NS3/NS4A、NS4BINS5A位点的裂解不能完成。而NS4A无论是与NS3共同表达,还是作为独立的分子均可辅助Cpro-2完成酶切活性。虽然NS3单独即可完成对NS4A/NS4B、NS5A/NS5B的切割,但NS4A可极大地提高其切割效率。NS4A长54个氨基酸,C端为疏水区,N端为亲水区。NS4A中央区域的疏水性氨基酸与其辅助因子功能有重要关系,缺失和突变实验表明,位于21-30的一段氨基酸序列为辅助因子活性所必需,对应22-34位氨基酸的合成肽可模拟NS4A辅助Coro-2的功能,因此,进一步确定其必需序列位于22-30该序列为Cys-22-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Val-30[24]。最近应用X线晶体衍射法对Cpro-2晶体结构进行了研究,其中一组对Cpro-2和NS4A复合体进行分析确认为糜蛋白酶样分子[25],另一组单独对Cpro-2进行分析确认为胰蛋白酶样分子[26]。对蛋白酶抑制实验显示,NS3-4A复合物蛋白酶活性可被糜蛋白酶样蛋白酶抑制剂抑制,不能被胰蛋白酶样蛋白酶抑制剂抑制,提示NS4A在蛋白酶活性中起重要作用。NS3蛋白酶在体内为异源二聚体蛋白质,包括NS3和NS4A,Satch S等构建了一系列NS3 N端和C端缺失的重组质粒,并与NS4A在COS细胞内一起表达,分别以抗NS3或抗NS4A抗体均可将NS3和NS4A共沉淀,提示二者为聚合体形式存在。缺失NS3 C端2/3部分,仍可观察到二者的相互作用,而在N端缺失22个氨基酸的缺失体NS3 1049-1215D,虽保持Cpro-2对NS5A/NS5B的切割活性,但已不能和NS4A共沉淀,重组载体表达的二氢叶酸还原酶(DHFR, dihydrofolate reductase)与NS3 N端22个氨基酸的融合蛋白,仍可与NS4A结合,表明NS3 N端22个氨基酸是NS3与NS4A相互作用形成聚合体的区域,N端22个氨基酸即可完成与NS4A的结合[27]。NS4A通过与NS3该区域相互作用调节酶的活性,因此,该区域对于Cpro-2 NS4A依赖性位点是必需的,但该区的缺失或突变并不影响NS3 pro-2催化中心与NS5A/5B位点的相互作用,Cpro-2仍可完成对NS4A非依赖位点的切割。

  NS4A激活Cpro-2的机制尚不清楚,推测可能为以下几方面作用:将NS3锚定于ER膜上,当HCV非结构蛋白在细胞内产生时,大部分成熟蛋白定位于细胞膜组分上,因此,通过NS4A将NS3定位于膜上,对于其切割NS4B/5A至为重要。其次,NS4A和Cpro-2结合,改变NS3底物结合“袋”的构型,识别并切割NS4A依赖性位点,或者,NS4A与Cpro-2相互作用,直接促进Cpro-2对NS4A依赖性底物的识别。其三,NS4A作为病毒编码的分子伴侣,辅助Cpro-2功能域的正确折叠。其四,NS4A与NS3功能域相互作用,改变切割位点的特异性,容许Cpro-2对NS4A依赖性位点的切割。其五,NS4A作为Cpro-2的亚单位,稳定NS3活性构型。上述假说均有待于进一步实验加以支持和验证[24、25、27]

  病毒重要的功能元件如病毒蛋白酶,ATP酶,解旋酶,RNA依赖性RNA合成酶等均位于非结构区,因此,病毒蛋白酶对非结构区的加工对病毒的成熟,病毒基因组的复制和表达以至病毒的生命周期都有着重要的调节作用,病毒蛋白酶功能的发挥与病毒和宿主细胞的相互作用以及病毒的致病机理等方面也有重要关系。对病毒蛋白酶生物学功能的调节是发展抗病毒药物重要的策略之一。对许多病毒来说,由病毒编码的蛋白酶介导的蛋白裂解加工,在病毒复制中起重要作用,如对黄病毒,灭活病毒蛋白酶或封阻某些特殊的切割位点,可终止病毒的复制,这些病毒蛋白酶及其相应的特异性底物,将是发展抗病毒治疗制剂重要靶位,对病毒蛋白酶功能及调节因素,病毒与底物的相互作用,Cpro-2与NS4A的关系的了解对于以酶结构为对象的抗病毒药物设计提供了重要信息。病毒蛋白酶对不同亚型有底物的有效切割,更为发展广泛适用于各种亚型的广谱抗病毒药物提供了可能,对HCV蛋白酶的深入研究将有助于发展有效的控制或清除HCV感染的有效的治疗方法。

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