当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 临床医学与专科论文 > 检验医学 > 乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达

乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
336*280 ads

摘要: 乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达 中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 基因工程抗体 作者:孟淑芳尹红章李德富王嘉玺 单位:孟淑芳 尹红章 李德富(中国药品生物制品检定所,卫生部质量控制及标准化研究重点实验室 北京,100050)。王嘉玺(军事医学科学院基础医学研究所) 关键词:单链抗体。抗乙脑病......


乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 基因工程抗体

作者:孟淑芳 尹红章 李德富 王嘉玺

单位:孟淑芳 尹红章 李德富(中国药品生物制品检定所,卫生部质量控制及标准化研究重点实验室 北京,100050);王嘉玺(军事医学科学院基础医学研究所)

关键词:单链抗体;噬菌体表面呈现;抗乙脑病毒

  【 摘要 】 目的 获得乙脑病毒(JEV)鼠源单链抗体基因(ScFv)并使其在E.coli中表达。方法 利用噬菌体表面呈现技术,从抗乙脑病毒杂交瘤细胞2H4中构建噬菌体抗体库,采用双抗体夹心模式对抗体库进行富集及检测。并将所获得的阳性克隆基因插入GST融合表达载体中,构建融合表达克隆,使其在E.coli中获得稳定表达产物。结果 所构建的噬菌体抗体库经3轮的吸附、洗脱及再感染的富集过程后,共检测到7株稳定的具有乙脑抗原结合活性的阳性克隆,对其中的mu2H4-3和mu2H4-36进行了序列测定。经分析,2个克隆的基因序列一致,其重链及轻链分别属于Kabat鼠抗体基因家族中第Ⅰ及κ第Ⅵ亚群。构建为融合表达载体pG51-mu2H4后,此单链抗体mu2H4在E.coli BL21中获得表达,产量约为菌体蛋白的10%。结论 从抗乙脑病毒杂交瘤细胞中克隆并表达了特异单链抗体片段mu2H4,为下一步的人源化改造提供了资料。

The construction and expression of the murine ScFv gene against encephalitis virus

MENG Shufang, YIN Hongzhang, LI Defu, et al.

  (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P. R. China)

  【 Abstract 】 Objective To obtain the gene of murine ScFv against encephalitis virus (JEV) and to express it in E. coli.Methods By the phage display technology the antibody library was constructed from hybridoma 2H4 against JEV. It was screened and detected by the Sandwich ELISA with antigen JEV. Then the positive gene fragment was inserted into GST fusion vector pGEX-5X-1 to express in E. coli stably.Results Through three panning of absorb, elution and reinfection, 7 clones were detected to be positive to JEV. And two of them, mu2H4-3 and mu2H4-36, were sequenced. After homology analysis, the gene sequence of these two clones were found to be identical, the heavy chain and light chain separately belong to Ⅰ and κⅥ subgroups in murine antibody family from Kabat library. The recombinant fusion vector pG51-mu2H4 expressed the product with 57 000 of molecular weight, which takes about 10% of the whole protein in E. coli BL21.Conclusion The ScFv gene (mu2H4) was cloned from hybridoma 2H4 against JEV and expressed in E. coli. It is potentially important for its humanization in the future.

  【 Subject words 】 ScFv; Phage display technology; Anti-encephalitis virus

  乙型脑炎病毒感染引起乙型脑炎,近年来,由于实行计划免疫其发病率有明显降低,但因人口流动,地区偏远等因素,仍时有病例发生。乙脑患者虽可保全生命,但约7%~20%的患者留有神经性后遗症,因此需要寻找有效的治疗方案〔1〕。第四军医大学马文煜教授等研制的具有病毒中和活性的乙型脑炎病毒单克隆抗体在乙脑患者治疗中显示了较好的治疗效果〔2〕。但全抗体分子较大,不易穿透血脑屏障,难以进入脑病变部位,尚不能达到更佳疗效〔3〕;单链抗体由多肽链连接的重链及轻链组成功能单位,具有分子质量小,穿透能力强,半衰期短等优点,因此在疾病治疗中具有一定的应用前景。我们以马文煜教授等的单抗杂交瘤细胞株作为原材料,制备单链抗体ScFv片段,使其在乙脑治疗中有进一步发展。

  材料与方法

  细胞株来源:抗乙型脑炎病毒杂交瘤细胞株2H4(第四军医大学免疫教研室制备)。

  试剂、菌株及质粒:mRNA提取试剂盒,重组噬菌体抗体系统(recombinant phage antibody systerm),包括:mouse ScFv module,expression module及detection module均购自Pharmacia公司。宿主菌BL21,本室保存,TG1,Phamarical公司。M13KO7辅助噬菌体,Promega公司,效价为1011PFU/ml。乙脑单抗MC3,本室制备,蛋白A亲和层析纯化,蛋白含量为2.6mg/ml。

  抗原结合板的制备:采用双抗体夹心法,MC3单抗15μg/ml,200μl/孔包被,37℃ 1 h后4℃过夜,5%脱脂奶粉PBS封闭,37℃ 1 h,加入1∶20倍稀释的乙型脑炎灭活抗原200μl/孔,37℃ 1 h后,备用。

  杂交瘤细胞mRNA的提取:根据试剂盒使用说明书操作。用oligo-dT纤维素柱吸附洗脱并纯化胞内mRNA,测定其浓度,浓缩后置于-60℃保存备用。

  噬菌体抗体基因库的构建、富集及克隆筛选:参照mouse ScFv module说明构建鼠源可变区基因VH及VL及ScFv基因。噬菌体抗体基因库的构建、吸附、洗脱、富集及检测,参照expression module及detection module的使用说明,并稍作改动。培养上清过滤后,加入2ml 20%PEG/2.5mol/L NaCl溶液,冰浴并4℃离心,沉淀用300μl 2×YT重悬后,加入100μl含10%脱脂奶粉的PBS,室温放置15 min,200μl/孔加至抗原结合板中。采用甘氨酸-HCl作为洗脱液,先加入50μl pH5.2的甘氨酸-HCl,37℃ 10 min,弃去液体,再加入50μl pH2.2的甘氨酸-HCl,37℃ 10 min后迅速加入3μl 2mol/L的Tris中和,收集洗脱液,感染处于指数生长期的TG1受体菌。如此进行3轮吸附、洗脱及富集。

  粗制包涵体的制备、变性及复性:1mmol/L IPTG于37℃诱导表达,收集菌体,冰浴10 min,5 000r/min离心10 min,沉淀用10ml预冷PBS洗涤1次,重悬于5ml PBS中,并加入1mmol/L PMST,250μl 10mg/ml溶菌酶,2μl 25μg/ml DNaseⅠ,颠倒混匀后,冰上放置30 min,-70℃过夜。次日水浴迅速融解沉淀,置于冰上,超声波破碎,4℃ 8 000r/min离心10 min,弃上清。沉淀中加入10ml RIPA(包涵体溶解液)[ 0.1%SDS,1%TritonX-100,1%脱氧胆酸钠,1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)于TBS中]洗涤2次,所得沉淀即为粗提包涵体。加入2倍体积的10% SDS变性,反复吹吸至包涵体溶解,迅速加入9倍体积的PBS中稀释,并用0.05% SDS-PBS透析过夜后,换用0.01% SDS-PBS继续透析24 h,测定蛋白浓度并分装保存,为复性的mu2H4。

  mu2H4对亲本单抗2H4的竞争抑制试验:MC3以15μg/ml包被,加入1∶4倍稀释的乙脑病毒培养上清,37℃ 1 h后,加入复性后的不同浓度的mu2H4与等体积HRP标记的亲本单抗2H4的混合物,37℃ 1 h,OPD显色,同时设抑制阴性对照。按公式计算mu2H4对亲本抗体的抑制率。大于50%时认为存在抑制关系。

  结果

  1.mRNA的提取:收集4瓶处于指数生长期的2H4细胞,共获得500μl浓度为7.616μg/ml产物,浓缩后,样品溶于20μl DEPC处理过的双蒸水中,浓度约为133μg/ml。

  2.鼠源ScFv基因库的构建及表面呈现阳性克隆的获得:以上述mRNA为模板经反转录及扩增后,分别获得约370bp VH及320bp VL基因(见图1中Lane 1、2)。将VH及VL基因混合,加入连接肽引物(linker)及重链和轻链双侧引物后,经2次扩增,获得全长约750bp的鼠源ScFv基因,结果见图1(lane 6、7)。将所得鼠源ScFv基因连接于pCantab5E(pC5E)噬菌粒载体上,构建成噬菌体抗体基因库。经3轮富集后,挑选46个克隆进行检测,共获得8株阳性克隆(表1),分别为mu2H4-3,-16,-19,-28,-35,-36,-37和-42。经SfiⅠ/NotⅠ限制酶切图谱分析,8株阳性克隆中均有750bp插入带。稳定性分析表明,mu2H4-28丢失抗原结合活性,其余7株稳定。

  图1 VH、VL及ScFv基因的制备

  Fig 1. The amplified fragments of VH, VL and ScFv gene

  1. VH gene,about 370bp; 2. VL gene,about 320bp; 3,4. VH fragment marker; 5. DNA marker,100bp ladder; 6,7. ScFv gene,about 750bp

  3.阳性克隆的序列测定结果:选择克隆mu2H4-3及-36进行序列测定,结果表明,这两株克隆的序列一致。DNA及蛋白质序列同源性比较结果表明,此序列属于鼠源抗体ScFv序列,其VH及VL分别属于鼠重链可变区第Ⅰ亚群及κ链第Ⅵ亚群,并根据Kabat法划分其序列CDR区(见图2)。

  4.鼠源ScFv片段mu2H4在融合表达载体中的克隆及表达:根据mu2H4序列测定结果,分别合成二条引物:5′-EcoRⅠ/TCAGAATTCATGGCCCAGGTCGAAC-3′及5′-NotⅠ/ATAAGAATGCGGCCGCCCGTTTGATT

  TG-3′,以mu2H4-3 DNA为模板扩增,获得mu2H4基因片段,与pGEX-5X-1连接,并转化BL21,获得阳性克隆pG51-mu2H4(见图3)。以1mmol/L IPTG诱导表达,10%SDS-PAGE检测,在相对分子质量(Mr)约57×103处有诱导表达产物(见图4),经UV扫描,此表达带约占菌体蛋白含量的10%。

表1 噬菌体抗体库的ELISA检测结果

  Table 1. The result of the phage antibody libray detected by ELISA

No.clone A490 value
mu2H4-3 1.412
mu2H4-16 1.458
mu2H4-19 1.269
mu2H4-28 0.967
mu2H4-35 1.022
mu2H4-36 1.347
mu2H4-37 1.261
mu2H4-42 0.985

  The average A490 value of other clones: 0.006

  图2 mu2H4 DNA及氨基酸序列

  Fig 2. The DNA and amino acid sequences of mu2H4

  ----: CDR regions

  图3 重组表达载体pG51-mu2H4的构建

  Fig 3. The construction of the recombinant pG51-mu2H4

  图4 10% SDS-PAGE检测图谱

  Fig 4. The result of electrophoresis by 10% SDS-PAGE

  Lane 1: low-molceular protein marker; Lane 2: whole extract of pG51-mu2H4 before induction by IPTG; Lane 3: whole extract of pG51-mu2H4 induced by 1mmol/L iPTG; Lane 4: whole extract of pGEX-5X-1 before induction; Lane 5: whole extract of pGEX-5X-1 induced by 1mmol/L IPTG; Lane 6: whole extract of host strain of BL21  5.mu2H4对亲本单抗的竞争抑制试验:mu2H4变性复性后,所得粗制单链抗体浓度为2.5mg/ml。如表2所示,当mu2H4的蛋白浓度稀释至0.2mg/ml时对亲本抗体2H4仍有抑制作用,这提示融合表达的mu2H4具有乙脑病毒抗原结合能力,且与亲本单抗的识别位点相似。

表2 mu2H4对亲本抗体2H4的抑制结果

  Table 2. The inhibition ratio of mu2H4 against parental antibody 2H4

Concentration of

  mu2H4(mg/ml)

2.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
The inhibition

  ratio

98.6% 89.4% 83.2% 77.9% 66.2% 51.2%

  讨论

  我们从具有中和活性的乙型脑炎病毒单克隆抗体细胞株2H4中得到了具有抗原结合活性的单链抗体片段基因。预实验结果表明,乙脑病毒包被能力及稳定性均较差,故采用双抗体夹心法,以另一株蛋白A亲和层析纯化的乙脑单抗MC3为包被抗体,以乙脑灭活疫苗浓缩液为夹心抗原,作为筛选及检测模式,可增加特异性。采用甘氨酸-HCl两步洗脱法也是为了提高特异性。

  在pG51-mu2H4的表达产物中除目的蛋白诱导带外(Mr约57×103),在45×103左右还有1条诱导带。表达产物经FactorXa裂解后,发现裂解产物中除31×103的mu2H4带及26×103的GST带外,尚有1条17×103左右带。基因序列的测定结果表明,在mu2H4的序列中不存在终止密码子,且有完整的蛋白表达产物,因此推测,可能主要由于表达产物对菌体具有毒性,部分产物被蛋白酶降解所致。

  噬菌体呈现技术的优点之一即是表型与基因型一一对应,在获得具抗原结合活性的阳性克隆时,即可通过测序而获得决定其表型的基因序列。在重组噬菌粒中,外源基因与噬菌体gⅢ蛋白融合〔4〕,而gⅢ蛋白为低拷贝外壳蛋白, 其大量表达对宿主菌具有毒性效应,因此在噬菌体呈现系统中,外源蛋白的表达量较低,仅用此表达量进行抗体其它活性分析是难以满足需要的,而且,由于其表达产物分泌于培养上清液中,易于被菌体蛋白酶所降解而影响其稳定性,不利于其特性的分析。另外,由于ScFv仅为抗体分子可变区片段,无适合的检测抗体,为方便使用,在克隆时需选用带有检测标记的载体,如带有TagE, His ,GST,T7等的载体,且已有市售的抗此类标记的抗体。在本实验中使用带有GST的表达载体pGEX-5X-1,获得稳定的重组表达载体pG51-mu2H4,且表达产物经变性及复性后,具有乙脑病毒抗原结合能力,且与亲本单抗2H4的抗原识别位点相似。

  参考文献

  1,张明杰, 汪美先, 姜绍谆, 等. 单克隆抗体治疗日本乙型脑炎的实验研究. 病毒学杂志, 1987, 4:27-32.

  2,刘俊彬,马文煜,朱平, 等. 鼠源性日本脑炎病毒单克隆抗体临床探索性治疗. 中国人兽共患病杂志, 1995, 5-A:215-218.

  3,黄庆生, 马文煜,姜绍谆, 等. 鼠源性单克隆抗体在乙脑患者体内动态的初步观察. 单克隆抗体通迅, 1995, 11(1):10-12.

  4,BarbasIII CF, Kang AS, Lerner RA, et al. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the geneⅢ site. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:7978-7982.

(收稿日期:1999-09-11)



医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: