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HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定 中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 基因工程抗体 作者:成军钟彦伟施双双王刚董菁夏小兵杨继珍陈菊梅 单位:解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京,100039 非结构蛋白NS5A是丙型肝炎病毒(HCV)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的......


HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 基因工程抗体

作者:成军 钟彦伟 施双双 王刚 董菁 夏小兵 杨继珍 陈菊梅

单位:解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京,100039

  非结构蛋白NS5A是丙型肝炎病毒(HCV)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的HCV非结构蛋白NS5A为包被抗原,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的HCV NS5A人源单链噬菌体抗体,并对其进行了DNA序列测定。

  本研究所用的HCV NS5A抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白,以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证实纯度在95%以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接的半合成抗体文库。M13K07购于Pharmacia公司,DNA质粒提取纯化试剂盒购于Wizard公司。其它试剂均为国产分析纯。

  特异性HCV NS5A人源单链噬菌体抗体的筛选采用5次“吸附、洗脱、扩增”过程(中华传染病杂志2000, 18:84~87)。将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿,从中挑选35株单克隆菌株,置于2×TY(氨苄青霉素100mg/L)中,37℃培养过夜。加入辅助噬菌体M13K07侵染后,30℃培养过夜。上清液用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测。对筛选得到的阳性克隆重复ELISA检测过程。由于纯化的HCV NS5A蛋白保存于含有牛血清白蛋白中,因而从理论上来讲有可能筛选到牛血清白蛋白特异性的单链噬菌体抗体。以牛血清白蛋白作为包被抗原,结合交叉反应情况,最后确定1株强阳性克隆,用作进一步的研究。对筛选得到的阳性克隆菌株按照Wizard质粒DNA纯化试剂盒方法提取质粒,进行DNA序列测定。

  以固相化的重组HCV NS5A作为抗原,对噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,噬菌体抗体的富集达200倍。随机挑选35个克隆,用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与HCV NS5A抗原结合活性。其中有15株ELISA的A值较高。对这些噬菌体抗体进行交叉反应试验后,确定有5株与其它类型的蛋白质的交叉反应较弱,结合几次ELISA重复试验的A值,最后确定1株阳性克隆。5株HCV NS5A噬菌体单链可变区抗体的ELISA法鉴定结果A450nm其吸光度在1~1.8之间,阳性对照为1.4,阴性对照<0.5。从筛选得到的阳性克隆菌株提取质粒,进行DNA序列测定。基因序列已被收入美国核苷酸数据库GenBank,收录号为AF236815。

  噬菌体抗体库能在体外通过相应筛选噬菌体抗体而获得特异性的人单克隆抗体,解决了杂交瘤技术不易生产人源单抗的问题。蛋白酶的抑制剂在抗人免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染的治疗中具有十分重要的作用和地位。因而人们推测通过寻找HCV NS5A蛋白的抑制剂,可能是探索抗HCV治疗方法的重要途径。关于HCV NS5A单链抗体基因的抗HCV基因治疗研究正在进行之中。

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39900130)

(收稿日期:2000-03-15)



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