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一株可识别胸腺基质内上皮细胞与血管系统的单链抗体

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 一株可识别胸腺基质内上皮细胞与血管系统的单链抗体 中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体 作者:姜宇飞陈慰峰Willem van Ewijk 单位:姜宇飞 陈慰峰(北京大学医学部免疫学系)。Willem van Ewijk(荷兰鹿特丹Erasmus大学免疫学系) 胸腺是T细胞分化和发育的主要场所〔1〕,胸腺前体细......


一株可识别胸腺基质内上皮细胞与血管系统的单链抗体

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体

作者:姜宇飞 陈慰峰 Willem van Ewijk

单位:姜宇飞 陈慰峰(北京大学医学部免疫学系);Willem van Ewijk(荷兰鹿特丹Erasmus大学免疫学系)

  胸腺是T细胞分化和发育的主要场所〔1〕,胸腺前体细胞进入胸腺以后通过不断的迁移与胸腺微环境中各种成分相互作用,经历阳性选择和阴性选择形成功能成熟的T细胞〔2〕。胸腺微环境是一个高度异质化的环境,成分复杂,包括基质细胞、细胞外基质、细胞因子、激素等等。每种成分在T细胞的发育中可能起着不同的作用。

  噬菌体抗体库中存在对各种各样抗原特异的抗体,van Ewijk实验室应用半合成的抗体库对胸腺的基质进行了研究,并得到了3个针对不同基质细胞的单链抗体〔3〕。在重新筛选和分析抗体库的过程中我们获得了一个新的单链抗体,此抗体可辨认胸腺内上皮细胞亚群及血管系统成分。

  材料和方法

  噬菌体抗体库:此抗体库由Utrecht Universtity Hospital的Ton Logtenberg教授惠赠〔4〕

  细胞系:(1)胸腺髓质型上皮细胞系MTEC1,(2)胸腺树突状细胞系MTDC,(3)胸腺上皮样基质细胞系TNC R3.1,(4)胸腺纤维母细胞样细胞系TST-4,(5)脑内皮细胞系bEND3,(6)胸腺皮质型上皮细胞系TEC1C8。所有细胞均培养于含5% CO2的37℃孵箱中,所用培养基为RPMI 1640含10%胎牛血清。

  单链抗体的小量制备:参见参考文献〔3〕。

  免疫组织化学染色分析:参见参考文献〔3〕。

  流式细胞计(FACS)染色分析:各种类型的细胞系在培养瓶中生长到合适的密度以后,用PBS冲洗1遍,加入含有0.1% EDTA的PBS并在37℃孵育10min使细胞松散。收集细胞,重悬在FACS缓冲液中并调整细胞浓度为2×106/ml。在96孔板中每孔加入105细胞,并加入单链抗体在冰上60min。用FACS缓冲液冲洗细胞2次,加入FITC标记的二抗9E10(FITC-9E10),在冰上30min。用FACS缓冲液冲洗细胞3次,将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中。样品的测量在FACScan流式细胞计上进行。

  单链抗体分子序列的测定:参见参考文献〔3〕。

  结果和讨论

  1.单链抗体TB3-110在正常组织中的特异性:经过筛选及分析我们挑选到一个具有全新染色类型的单链抗体,将其命名为TB3-110。此抗体能辨认散布在胸腺中的血管、小动脉、小静脉。同时,此抗体还能辨认在胸腺的皮质区及胸腺的髓质区分布稀疏的基质细胞亚群。这些细胞可在血管之间形成连接。另外,在胸腺髓质区此抗体还能辨认血管周围间隙的基底膜。在脾脏中,TB3-110能辨认脾脏白髓中的中央动脉。在脾脏红髓中,TB3-110可识别其中散布的小血管,还能辨认红髓中的网状细胞。在淋巴结中,此抗体对高内皮微静脉(HEV)有很强的反应性。以前的实验及本实验证明,用胸腺组织块作为靶抗原来富集筛选噬菌体抗体库,所挑选出来的单链抗体均不是胸腺特异的〔3〕。这说明在胸腺基质中存在着大量和外周组织相同的共同抗原。

  2.单链抗体TB3-110在细胞系上的反应性:为了明确此抗体辨认的抗原分布的细胞类型及此抗原是否表达在细胞表面,我们选择了几株小鼠的胸腺基质细胞系及来源于小鼠大脑的内皮细胞系,用流式细胞计(FACS)的方法来检测此抗体的反应性。FACS数据表明,此抗体识别的抗原表达在某些细胞的表面。此抗体在胸腺髓质型上皮细胞系MTEC1、胸腺基质细胞系TNC R3.1、胚胎胸腺纤维样细胞系TST-4及胸腺树突状细胞系MTDC上呈不同程度的阳性反应,而在胸腺皮质型上皮细胞系TEC1C8、内皮细胞系bEND3上则呈阴性反应(见图1)。FACS结果显示,应用固定的组织来富集筛选抗体库是可以得到针对细胞表面抗原的抗体。此发现对于应用抗体库技术快速寻找细胞表面的未知抗原有极大意义。

  3.单链抗体TB3-110的序列分析:序列分析结果表明,编码单链抗体TB3-110的抗体可变区片段分别来自VH1家族及Vκ1家族。单链抗体TB3-110的VH段CDR3区的氨基酸序列为GLLLSQFDS。通过对比VBASE抗体基因库,此序列为一新序列。

  图1 TB3-110在各种细胞系上的反应性

  由于单链抗体TB3-110能够辨认基底膜成分,而基底膜的成分主要有层粘连蛋白、纤维粘连蛋白及Ⅵ型胶原。因此我们做了TB3-110与抗层粘连蛋白抗体及抗纤维粘连蛋白的抗体阻断实验,结果显示,抗层粘连蛋白抗体及抗纤维粘连蛋白抗体均不能阻断TB3-110的结合,所以TB3-110辨认的是一个不同于这两个抗体所能识别的一个新的抗原决定簇。

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39707410);荷兰KNAW基金资助项目

参考文献

  1,Metcalf D. In “The Thymus” (D. Metcalf, Ed.). Springer-Verlag, New York, 1966, Vol.5, p.1.

  2,Boyd RL, Tucek CL, Godfrey DI, et al. The thymic microenvironment. Immunol Today, 1993, 14:445-459.

  3,van Ewijk W, de Kruif J, Germeraad WTV, et al. Subtractive isolation of phage-displayed single-chain antibodies to thymic stromal cells by using intact thymic fragments. Proc Natl Acad USA, 1997, 94:3903-3908.

  4,de Kruif J, Boel E, Logtenberg T. Selection and application of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J Mol Biol, 1995, 248:97-105.

(收稿日期:1999-06-04)



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