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抗伤寒沙门菌SOD血清的制备及其免疫保护作用的研究

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 抗伤寒沙门菌SOD血清的制备及其免疫保护作用的研究 中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 疫苗学 作者:徐军发唐湘涓 单位:广东医学院检验系 关键词:伤寒沙门菌。鼠伤寒沙门菌。Fe-SOD。免疫保护作用 【 摘要 】目的制备抗伤寒沙门菌Fe-SOD血清,研究其免疫保护作用,探讨SOD与沙门菌毒力的关系。...


抗伤寒沙门菌SOD血清的制备及其免疫保护作用的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 疫苗学

作者:徐军发 唐湘涓

单位:广东医学院检验

关键词:伤寒沙门菌;鼠伤寒沙门菌;Fe-SOD;抗血清;免疫保护作用

  【 摘要 】 目的 制备抗伤寒沙门菌Fe-SOD血清,研究其免疫保护作用,探讨SOD与沙门菌毒力的关系。 方法 用纯化的伤寒沙门菌(Stw1)Fe-SOD免疫家兔制备兔抗Fe-SOD血清。利用ELISA法检测抗血清的效价。免疫电泳、双向琼脂扩散试验和抗体对酶活性抑制试验分析抗血清的特性。用不同浓度的抗血清预先处理Stw1,然后进行小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬杀菌试验,并利用鼠伤寒沙门菌感染小鼠模型证明抗SOD血清的被动免疫保护作用。 结果 抗血清的ELISA效价为1∶10240,免疫电泳结果显示纯化的Fe-SOD及伤寒沙门菌无细胞溶解物与抗Fe-SOD血清在相同位置各形成一条沉淀线。双向琼脂扩散试验结果显示该抗血清与牛红细胞SOD不形成沉淀线,抗血清对酶活性抑制试验结果显示抗血清可抑制伤寒沙门菌及鼠伤寒沙门菌无细胞溶解物中部分SOD活性,对牛红细胞SOD的抑制率较低。小鼠腹腔吞噬细胞对伤寒沙门菌的吞噬杀菌试验结果显示,经中浓度的抗血清处理的细菌在60min、120min时和经高浓度抗血清处理的细菌在30min、60min及120min时CFU值明显低于对照组(P<0.01)。经抗血清处理过的5LD50鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠3d和7d的存活率分别为90%和60%,均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。 结论 抗伤寒沙门菌SOD血清可促进小鼠腹腔吞噬细胞对伤寒沙门菌的杀灭,也能提高鼠伤寒沙门菌攻击小鼠的存活率,说明此抗血清具有免疫保护作用,提示SOD可能是沙门菌共同的保护性抗原,间接说明了伤寒沙门菌的SOD与其毒力有关。

Preparation of anti-Salmonella typhi Fe-SOD

  and its immuno-protection

XU Junfa, TANG Xiangjuan. Department of Laboratory Medicine, Guangdong Medical College, Zhanjiang, P.R.China

  【 Abstract 】 Objective To prepare the anti-Salmonella typhi Fe-SOD and to study the immuno-protection of this antiserum. Methods The anti-Fe-SOD was raised in the rabbit immunized and then titrated by ELISA. The antiserum were further characterized by immuno-eletrophorisis, double agar difusion, enzym activity inhibition and opsonization test with murine peritoneal macrophages. Results The titer of the antiserum was 1∶10240. The cell-free extracts and the purified Fe-SOD from S.typhi but not the SOD from bovine RBC formed identical precipitation line with the antiserum. The 63.39%-73.38% of SOD activities in cell-free extracts from different S.typhi were inhibited by the antiserum as shown in NBT reduction inhibition test, but only 42.59% and 24.92% SOD activity from S.typhimurium and bovine erythrocyte were inhibited, respectively by the antiserum(P<0.01 or P<0.05). The bacteria number of test groups where 1ml or 2ml of the anti-SOD were added were both much less than that in the control groups at 30min, 60min and 120min, respectively in a phagocytic killing test by murine peritoneal phagocytes (P<0.01). The survival rates of mice in the group challenged with 5LD50 S.typhimurium incubated with anti-Fe-SOD serum were 90% and 60% during a period of 3 days and 7 days, respectively. Conclusion The results showed that the anti-Fe-SOD could not only strengthen the phagocytic killing of the bacteria by murine peritoneal phagocytes in vitro but also offers cross immuno-protection to the mice challenged with S.typhimurium. The SOD seems to function as common protective antigen of Salmonella.

  【 Subject words 】 S.typhi; S.typhimurium; SOD; Antiserum; Immuno-protection

  吞噬细胞呼吸爆发过程中产生的超氧阴离子(O2)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH*)和单线态氧(1O2)是重要的杀微生物物质〔1〕。病原微生物,尤其是细胞内寄生的细菌具有多种抗吞噬细胞杀伤的机制,其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalases,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)等可分解吞噬细胞产生的活性氧,从而保护细菌逃避吞噬细胞的杀伤。因此,SOD、CAT、POD被认为是某些细菌重要的毒力因子〔1〕。已有报道,星形诺卡菌〔2,3〕结核分枝杆菌〔4〕、福氏志贺菌〔5〕、大肠杆菌〔6〕等的SOD与其毒力有关。星形诺卡菌SOD抗体能增强吞噬细胞对该菌的吞噬杀菌作用〔2,3〕。关于沙门菌SOD与其毒力的关系目前未见报道。本研究制备了兔抗伤寒沙门菌(Stw1) Fe-SOD血清,并对其免疫保护作用进行了研究。

  材料和方法

  动物和菌株:新西兰白兔、昆明种小鼠均由广东医学院实验动物中心提供;4株野生型伤寒沙门菌(分别简称为Stw1、Stw2、Stw3和Stw4,抗原类型均为O9ViHd)。伤寒沙门菌H901(简称为H901)、疫苗候选株(ty21a)及鼠伤寒沙门菌毒力株(Stm,抗原类型为O4.5.12Hi.1.2)均由贵阳医学院免疫学教研室唐俊杰教授赠送。

  仪器和试剂:DG3022酶标仪(国营华东电子管厂);伤寒沙门菌Fe-SOD(Stw1 Fe-SOD,由贵阳医学院免疫学教研室提取,比活性为3270U/mg)〔7〕;抗伤寒沙门菌O901血清(本室自制,凝集效价为1∶2560);牛红细胞SOD(Sigma,比活性为3000U/mg);卡介苗(兰州生物制品研究所),羊抗兔IgG酶标抗体(北京生物制品研究所)等。

  抗Stw1 Fe-SOD血清的制备:将纯化的Stw1 Fe-SOD加弗氏完全佐剂免疫家兔,制备兔抗Fe-SOD血清。用ELISA法检测抗血清效价,免疫电泳法检测抗血清纯度。

  抗血清特异性鉴定:用纯化的Fe-SOD和牛红细胞SOD与抗Fe-SOD血清作双向琼脂扩散试验。

  抗血清对不同来源SOD活性的抑制作用:先对抗血清的浓度进行选择。取含1U SOD不同细菌无细胞溶解物及1U牛红细胞SOD加入经选定浓度的抗血清量,37℃作用30min后按NBT还原法检测SOD活性〔8〕,并计算其抑制率〔4〕

  抗Fe-SOD血清对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响:取小鼠腹腔吞噬细胞,用Hanks液稀释至2×106个/ml。用分光光度法测定细菌浓度。参照文献〔2,9,10〕方法检测抗Fe-SOD血清对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响。实验分3组,称为实验组1、实验组2和实验组3,分别取0.5、1.0和2.0ml兔抗Stw1 Fe-SOD血清,每组各加入8×106CFU的Stw1和0.05ml新鲜鼠血清,并用Hanks液补足少加的抗体量,混匀,置37℃ 30min后,各加入2×106个小鼠腹腔吞噬细胞,充分混匀,然后分成5管。从其中1管取0.1ml加入0.9ml无菌蒸馏水室温10min溶解细胞并作适当稀释,用倾注平板法检测CFU值,其余各管放37℃,并以第一管加入蒸馏水时作为0时刻,分别在15、30、60、120min取出一管检测CFU值,一式3份。此外设立4个对照组(分别称为对照组1、2、3、4)。其中对照组1不含吞噬细胞,对照组2不含鼠血清(抗血清浓度同实验组3),对照组3不含抗血清和鼠血清,对照组4用正常兔血清代替抗血清。并将上述实验重复做1次,共一式6份。以CFU的均值作为不同时刻的细菌存活数。

  统计学处理:计量资料用

  结果

  1.抗血清的效价和纯度:抗血清的ELISA效价为1∶10240,经免疫电泳后兔抗Stw1 Fe-SOD血清与纯化的Stw1 Fe-SOD及Stw1无细胞溶解物在相同位置均只形成一条沉淀线(图1)。

  图1 免疫电泳结果

  Fig 1. Result of immunoelectrophoresis

  a. Purified Stw1 Fe-SOD; b. Cell-free extracts of Stw1; c. Rabbit anti-Stw1 Fe-SOD

  2.双向琼脂扩散试验结果:图2显示抗Fe-SOD血清只与纯化的Stw1 Fe-SOD形成沉淀线,与牛红细胞SOD之间不形成沉淀线。   

  图2 双向琼脂扩散试验结果

  Fig 2. Result of double agar diffusion

  a. Purified Stw1 Fe-SOD; b. Bovine erythrocyte SOD; c. Rabbit anti-Stw1 Fe-SOD

  3.兔抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源SOD活性的抑制作用:图3显示,当抗血清浓度为50 ELISA单位时对1U Stw1 Fe-SOD的抑制率已达高峰,故选择50 ELISA单位作活性抑制试验。表1表示50 ELISA单位的兔抗Fe-SOD血清对1U不同来源的SOD活性的抑制率。可见抗血清对不同株伤寒沙门菌1U SOD活性的抑制率差异无显著性,对Stm SOD活性的抑制率低于伤寒沙门菌(P<0.05),对牛红细胞SOD活性的抑制率仅有24.92%明显低于其它组(P<0.01)。

  表1 抗Stw1 Fe-SOD对不同来源SOD活性的抑制作用

  Table 1. The inhibition rate of different SOD activity by rabbit anti-Stw1 SOD of 50 ELISA Units (n=10)

SOD Inhibitory rate (%)
Stw1

73.38±13.84

Stw2 71.26±15.39
Stw3 66.21±13.01
Stw4 68.87±14.21
H901 69.32±14.22
ty21a 63.39±15.76
Stm 42.58± 9.33*
Erythrocyte SOD 24.92± 7.64**

Compared with Stw1,**P<0.01,*P<0.05

表2 抗Stw1 Fe-SOD对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响

  Table 2. Effect of the anti-Stw1 Fe-SOD on phagocytic killing of Stw1 by murine peritoneal macrophages (106 CFU)

Group Time (min)
0 15 30 60 120
Test1

1.60±0.15

1.63±0.12

1.60±0.15

1.63±0.13

1.56±0.14

Test2 1.57±0.14 1.51±0.12 1.44±0.12 1.31±0.12* 1.29±0.11*
Test3 1.56±0.14 1.46±0.11 0.89±0.11* 0.78±0.13* 0.59±0.10*
Control1 1.59±0.13 1.61±0.14 1.62±0.15 1.59±0.10 1.68±0.11
Control2 1.57±0.11 1.50±0.12 1.02±0.13* 0.85±0.14* 0.72±0.12*
Control3 1.62±0.14 1.58±0.13 1.56±0.13 1.59±0.12 1.59±0.10
Control4 1.57±0.11 1.63±0.12 1.59±0.12 1.55±0.15 1.61±0.16

  *Compared with the control group 1,3,4 or the 0 min of the same group,P<0.01

表3 抗Stw1 Fe-SOD对Stm感染小鼠的交叉免疫保护作用

  Table 3. Effect of the anti-Fe-SOD on survival of mice challenged with different dose of Stm (survival/total)

  3 d 7 d
5LD50 10LD50 20LD50 5LD50 10LD50 20LD50
Anti-SOD   9/10* 4/10 1/10   6/10** 2/10 0/10
Anti-O901 3/10 1/10 0/10 1/10 0/10 0/10
Normal rabbit serum 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10

  Compared with normal rabbit serum,**P<0.01;*P<0.05

  图3 不同浓度的抗血清对1U Stw1 SOD活性的抑制率

  Fig 3. The inhibition rate of 1U Stw1 SOD by different concentrations of anti-Stw1 Fe-SOD serum

  4.抗Stw1 Fe-SOD血清对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响:经分光光度法测定,当细菌悬液的A600值为1.0时Stw1的浓度为1010CFU。表2显示,实验组2在60和120min时、实验组3和对照组2在30、60、120min时CFU值明显低于其它对照组及同组的0时刻(P<0.01),对照组2在30、60、120min时CFU值略高于实验组3,但差异无显著性(P>0.05),其它各组之间,及同组的不同时刻之间,CFU值差异无显著性(P>0.05)。  5.抗Fe-SOD血清对Stm感染小鼠的交叉免疫保护作用:经测定Stm的LD50为105.12。表3显示,抗Fe-SOD血清处理过的5LD50 Stm攻击的小鼠3d和7d存活率分别为90%和60%,均明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05),而抗O901血清与正常兔血清组之间无差异。

讨论

  沙门菌被吞噬细胞吞噬后可以抵抗吞噬细胞的杀菌作用,形成不完全吞噬。关于沙门菌的抗吞噬作用机理尚未完全阐明,但SOD有可能与沙门菌的抗吞噬作用有关〔10,11〕。伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌的无细胞溶解物经PAGE后具有3条SOD活性带〔7〕。有报道大肠杆菌具有Fe-SOD和Mn-SOD,且Fe-SOD位于细胞周质中在抵抗外源性及细胞质中产生的O2的损伤中起重要作用,而Mn-SOD位于细胞质中靠近细胞核,在抗内源性O2的损伤,保护DNA中起重要作用〔12,13〕。因此,在抗吞噬细胞杀伤中Fe-SOD可能较Mn-SOD更为重要,故我们选择了Fe-SOD作为靶抗原,探讨抗SOD血清的免疫保护作用,阐明SOD与沙门菌毒力的关系。

  免疫电泳结果显示,抗Stw1 Fe-SOD血清与Stw1 无细胞溶解物及纯化的Stw1 Fe-SOD在相同位置各只形成一条沉淀线,表明抗血清纯度较高,抗血清只针对Fe-SOD,不和细菌无细胞溶解物中其它成分起反应。双向琼脂扩散试验结果显示抗Stw1 Fe-SOD不与牛红细胞SOD形成沉淀线,而抗血清对酶活性抑制试验结果显示,抗Stw1 Fe-SOD只能抑制24.92%的牛红细胞SOD活性,说明牛红细胞SOD与Stw1 Fe-SOD有低度交叉反应。抗血清对不同株伤寒沙门菌SOD活性的抑制率无明显差异,而对Stm SOD活性的抑制率低于伤寒沙门菌(P<0.05),说明Stm Fe-SOD和Stw1 Fe-SOD的抗原性有差异,或Stm无细胞溶解物中Fe-SOD含量较低。以上结果说明抗血清的特异性较好。因此,利用此抗血清进行免疫保护作用的研究是可行的。

  体外吞噬试验结果显示,中剂量的抗Stw1 Fe-SOD在60min和120min、高剂量的抗Stw1 Fe-SOD不论是否有新鲜鼠血清存在,于30、60和120min时CFU值均明显低于其它对照组和同组的0时刻(P<0.01);其它对照组不同时刻的CFU值无差异。说明了Stw1对小鼠腹腔吞噬细胞的杀伤有较强的抵抗力,而抗Fe-SOD能促进吞噬细胞对Stw1的杀灭,提示SOD与伤寒沙门菌的抗吞噬作用有关。高剂量的抗血清在有新鲜鼠血清存在时对小鼠腹腔吞噬细胞杀伤Stw1的促进作用略高于无鼠血清时,但差异无显著性,说明补体对抗Fe-SOD有协同作用,但其作用甚微。低剂量抗Stw1 Fe-SOD组与对照组差异无显著性,可能是因为:(1)SOD不是沙门菌抗吞噬作用的唯一因素,且伤寒沙门菌除Fe-SOD外尚含有Mn-SOD;(2)实际抗体含量较低,以致不能充分中和SOD活性。因此,尽管抗Fe-SOD血清能促进吞噬细胞对伤寒沙门菌吞噬杀菌功能,但其作用是有限的。

  抗Stw1 Fe-SOD能使受5LD50的鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠3d和7d的存活率分别为90%和60%,明显高于正常兔血清对照组(P<0.01或P<0.05),而抗伤寒沙门菌O901血清组与正常兔血清组间无差异(P>0.05)。抗Fe-SOD可抑制Stm无细胞溶解物中42.58%的SOD活性〔7〕,当抗SOD在体外与Stm作用时可与细菌SOD结合,注入机体后一方面抑制细菌SOD活性,增强吞噬细胞的对细菌的杀伤;另一方面可激活补体,并导致趋化、溶菌和调理吞噬作用。鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌仅有O12为共同抗原,因此抗O901血清中抗O12的含量相应较少,故而缺乏免疫保护作用。抗Stw1 Fe-SOD对鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠显示出明显的保护作用,除说明抗SOD确有交叉免疫保护作用外,同时也提示SOD可能是沙门菌共同的保护性抗原。正因为抗Stw1 Fe-SOD只能抑制42.58%的鼠伤寒沙门菌SOD活性,因此对较大剂量Stm的攻击无保护作用。

  参考文献

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  8 徐军发, 凌天翼, 唐俊杰.用NBT还原法检测细菌无细胞溶解物中SOD活性.广东医学院学报, 1998, 16:12-14.

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  10 Papp-Szabo E, Firtel M, Josephy PD. Comparison of sensitivities of Salmonella typhimurium oxyR and katG mutants to killing by human neutrophils. Infect Immun, 1994, 62:2662-2668.

  11 Christman MF, Morgan RW, Jacobason FS, et al. Positive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat shock proteins in Salmonella typhimurium. Cell, 1985, 41: 753-762.

  12 Gregory EM, Yost FJ, Fridovich I. Superoxide dismutase of Escherichia coli: Intracellular localization and functions. J Bacteriol, 1973, 115:987-991.

  13 Hopkin KA, Papazian MA, Steinman HM. Functional differences between manganese and iron superoxide dismutase in Escherichia coli K-12. J Biolo Chem, 1992, 267:24253-24258.

(收稿日期:1999-02-01)



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