当前位置:首页 > 合作平台 > 医学论文 > 临床医学与专科论文 > 检验医学 > AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较

AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
336*280 ads

摘要: AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较 中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 检测技术 作者:黄健沈永生周宏平郑俊年王秀英 单位:江苏,徐州医学院附属医院中心实验室 检测细胞凋亡(APO)常用的有PI(碘化丙啶, propidium iodide)染色DNA的测定法和TdT(末端脱氧核苷转移酶, terminal deoxynucl......


AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 检测技术

作者:黄健 沈永生 周宏平 郑俊年 王秀英

单位:江苏,徐州医学院附属医院中心实验室

  检测细胞凋亡(APO)常用的有PI(碘化丙啶, propidium iodide)染色DNA的测定法和TdT(末端脱氧核苷转移酶, terminal deoxynucleotidyl transferase)法。AV(磷酯酰丝氨酸结合蛋白, Annexin)法是近年来提出的一种新方法。我们采用AV联合应用PI双参数法检测由地塞米松诱导小鼠胸腺产生凋亡细胞的百分率,并与上述二种方法作比较,以探讨其应用价值。

    表1 3种方法检测凋亡细胞比率的结果(%,

  例数 PI法 TdT法 AV法
凋亡 坏死 死亡
对照组  2 0

1.24± 0.74

13.12±1.53

1.45±0.58

15.03±0.72

凋亡组 10 27.19±7.10* 50.10±13.20** 32.28±7.02*** 13.25±5.53 45.62±10.38****

  注:1. 死亡=凋亡+坏死; 2. 均为配对t检验; 3. *与**相比较:P<0.01; **与***相比较: P<0.01; *与***相比较:P<0.01 ; **与****相比较:P>0.05

  材料和方法

  试剂:AV试剂盒,法国国际免疫公司产品,内含PI染液(250μg/ml)。TdT试剂盒,德国Boehringer Mannheim公司产品。自配检测DNA含量的PI(50μg/ml)染料。

  流式细胞仪:FACS Calibur(美国BD公司)。

  标本处理:取10只小鼠,分别于腹腔注射地塞米松25mg/kg,另取2只注射等量生理盐水作对照。10h后处死小鼠,开胸取胸腺,常规制备细胞悬液,调整细胞浓度为106/ml备用。

  实验方法

  AV法测定:取106个上述细胞用PBS洗涤、离心(2000r/5min)、去上清后按试剂说明操作。

  DNA含量测定:取106个细胞加入PI染液1ml放冰箱30min待测。

  TdT测定法:取106个细胞用1%的多聚甲醛冰浴固定15min,离心去上清,70%冷乙醇固定24h,然后按试剂说明书操作。

  FCM检测:3种方法染色的标本分别上机检测,每次获取30000个细胞,保存数据后用Cell Quest软件进行分析。

  结果与讨论

  本实验3种方法检测小鼠胸腺细胞凋亡的结果见表1。流式细胞术检测细胞凋亡最早使用的是PI法,其结果是在正常的G0/G1峰之前有一亚二倍体峰。凡DNA含量小于二倍体的细胞均被认为是凋亡细胞。但Cohen等在实验中发现典型的凋亡形态并不一定伴有核小体间DNA降解及断裂〔1,2〕。此外,郑泽铣等利用双激光双染色法证实了亚二倍体并不一定是凋亡细胞。因此利用PI法检测凋亡可能有很大的错检或漏检。本文结果也证实,PI法敏感性低、特异性差,故不适宜定量检测细胞凋亡。

  TdT法是利用其介导荧光素标记的dUTP掺入到降解后DNA片段的3′羟基末端,根据掺入的荧光强度可定量细胞的凋亡率。据Mundle等报道,早期凋亡细胞易被TdT介导的dUTP标记,但是坏死期的细胞由于内源性核酸内切酶和蛋白酶的作用,DNA被切割为大小不等的片段,此时也会出现TdT法假阳性〔3〕。本文TdT法的阳性率显著高于其它2组,表明其敏感性较高。它与AV法中死亡(凋亡+坏死)率之间差异无显著性,进一步提示TdT法的凋亡阳性率实际反映了细胞凋亡与坏死的总和,显示其特异性较差。王振义、陈竺等也证实DNA裂解并非凋亡所特有,因此,TdT法对凋亡的检测只能是选择性的,而不是特异性的。

  对APO的进一步研究表明,各种细胞受到诱导后产生凋亡的初期,均会出现膜内外层面磷酯酰丝氨酸(PS)重新分布,即膜内表面的PS发生不可逆转的外露,其明显地早于核内DNA固缩、变性、裂解〔4〕,检测外表面的PS,可了解凋亡的早期状况。Annexin-V与PS有较强的亲和力,具有钙依赖性。由于坏死细胞的PS也有外露现象,因此单纯利用荧光素标记的Annexin-V无法区分凋亡和坏死。必须联合应用可以进入破损细胞膜内与降解DNA结合的PI法,才能区分凋亡与坏死。本法根据膜的完整与否及PS的分布情况,可将待测细胞分为3群。AnnexinV-/PI-区活细胞、AnnexinV+/PI+区的继发性坏死细胞,AV和PI均高染、AnnexinV+/PI-区的凋亡细胞群,AV的荧光强度高但PI强度低。其次,已有研究表明,小鼠胸腺细胞可自发产生凋亡。本实验显示PI结果为0,TdT法仅为1.24%,而AV法为13.12%。因此可说明AV法较其它方法敏感。此外,本法不需对细胞进行固定,从而可以去除其它方法因对细胞进行固定而造成的碎片增多或DNA片段丢失的不良影响。AV法试剂的价格适中,较宜进行大批量科研标本检测。

  综上所述,不同方法定量APO的结果存在显著差异。AV法能检测早期的凋亡,可正确区分凋亡和坏死,实验中不需固定细胞,影响因素较少。因此,利用流式细胞术检测APO时,宜首选AnnexinV/PI双参数法。

参考文献

  1,Oberhammer F, Wilson JW, Dive C, et al. Apoptosis death in epithelial cell: cleavage of the absence of internucleosomal fragmentation. Embo J, 1993, 12:3679-3684.

  2,Cohen GM, Sun XM, Snowden RT, et al. Key morphologocal features of apoptosis may occur in the absence of internucleosomal DNA fragmentation. Biochem J, 1992, 286:331-334.

  3,Mundle SD, Raza A. The two in situ techniques do not differentiate between apoptosis and necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in apoptosis. Lab Invest, 1995, 72:611-613.

  4,Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger CPM. A novel assay for apoptosis: Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptoic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods, 1995, 180:39-51

(收稿日期:1999-07-12)



医学百科App—医学基础知识学习工具


页:
返回顶部】【打印本文】【放入收藏夹】【收藏到新浪】【发布评论



察看关于《AnnexinV/PI、TdT和PI法检测细胞凋亡的比较》的讨论


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容
联系Email: