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志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力 中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 疫苗学 作者:林纪胜徐建国 单位:102206 北京,中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所卫生部医学分子细菌学重点实验室 关键词:志贺氏菌。免疫原性。疫苗 【 摘要 】目的研制多价、安全、高效和......


志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 疫苗学

作者:林纪胜 徐建国

单位:102206 北京,中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所卫生部医学分子细菌学重点实验室

关键词:志贺氏菌;免疫原性;疫苗

  【 摘要 】 目的 研制多价、安全、高效和无抗生素抗性的志贺氏菌疫苗。方法 利用动物模型,评价志贺氏菌双价(S.flexneri 2a -S.dysenteriae I)疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力。结果 DOM3的残余毒力分别比野生型毒株S.flexneri 2a 301和S.dysenteriae I 112低120倍和57倍(昆明系小鼠),873和195倍(SPF BALB/c小鼠)。DOM3丧失了侵袭上皮细胞的能力。DOM3具有和S.flexneri 2a 301几乎相同的免疫原性,但较S.dysenteriae I 112 的免疫原性略差。皮下免疫小鼠血清中特异性抗体IgA、IgG滴度峰值出现在最后一次皮下注射的第2周, 而IgM滴度峰值出现在第1周, 然后滴度逐步下降, 在6周后趋于稳定。血清中同时具有抗S.flexneri 2a 菌和抗S.dysenteriae I 菌的抗体, 且其滴度变化的趋势基本一致。使用昆明系小鼠,以30 LD50(6.13×107CFU) 的野生型毒株S.flexneri 2a 301和21 LD50(6.26×107 CFU) 野生型毒株S.dysenteriae I 112 攻击,保护率分别为90%和70%; 使用SPF BALB/c小鼠,以20 LD50(1.38×106 CFU)的 S.flexneri 2a 301和23 LD50( 6.95×106 CFU )的S.dysenteriae I 112攻击,保护率分别为100%和80%;与生理盐水和E.coli LE392对照比较,差异均具有显著性(P<0.05)。结论 志贺菌双价疫苗候选株DOM3是一株有希望的疫苗候选株,为今后DOM3的安全性和免疫原性志愿者试验及疫苗改进提供了依据。

Animal study for residual virulence, immunogenicity and protective effect of alive bivalent Shigella vaccine candidate strain DOM3

LIN Jisheng, XU Jianguo. The Priority Laboratory of Medical Molecular Bacteriology of the Ministry of Health, Institute of Epidemiology and Microbiology, CAPM, Beijing 102206

  【 Abstract 】 Objective To develop a polyvalent, safe, highly effective and non-antibiotic resistance vaccine.Methods Animal model was used to evaluate the residual virulence, immunogenicity and protective effect of a live bivalent Shigella vaccine candidate strain DOM3(expressing S.flexneri 2a and S.dysenteriaeⅠ somatic antigen) constructed by balanced plasmid-chromosome lethal gene expressing system based on thyA gene.Results The virulence of DOM3 was 120 and 57 times respectively less than that of the wild type strains S.flexneri 2a 301 and S.dysenteriaeⅠ112 in Kunming mice, 875 and 195 times respectively less than that of wild type strains S.flexneri 2a 301 and S.dysenteriae Ⅰ112 in SPF BALB/c mice. DOM3 had the similar immunogenicity to S.flexneri 2a 301, but weaker immunogenicity than S.dysenteriae Ⅰ112. The peak of serum IgA and IgG of immunized mice appeared in the second week after the last injection, but IgM in the first week. Antibody titers were likely to be stable after 6 weeks. Anti-S.flexneri 2a and anti-S.dysenteriae Ⅰantibodies appeared with similar trendency. The mice subcutaneously inoculated with DOM3 could be protected from the challenge of 30 LD50 (6.13×107 CFU) wild type strain S. flexneri 2a 301 and 21 LD50(6.26×107 CFU) wild type strain S.dysenteriae Ⅰ112 respectively in Kunming mice, and 20 LD50(1.38×106 CFU) wild type strain S.flexneri 2a 301 and 23 LD50(6.95×106 CFU) wild type strain S.dysenteriae Ⅰ112 in SPF BALB/c mice, through intraperitoneal injection, the protective rate was 90% and 70% respectively in Kunming mice, and 100% and 80% respectively to SPF BALB/c mice.Conclusions DOM3 may be a promising Shigella vaccine candidate strain. Volunteer study on safety, immunogenicity should be done based on the results above.

  【 Subject words 】 Shigella species  Immunogenicity  Vaccine

  细菌性痢疾是发展中国家的主要肠道传染病,它严重影响着人们的健康,尤其是儿童的生长发育〔1~3〕。志贺氏菌是细菌性痢疾的病原菌。由于志贺氏菌血清类型多、致病性强(102~103CFU可以致病)〔4〕和耐药性的广泛存在〔5,6〕,给防治工作带来很大困难,因此多价、安全、高效、无抗生素抗性疫苗成为疫苗研究的重点。余秀军等〔7〕利用质粒-染色体致死平衡系统构建了以thyA基因为选择压力的无抗生素抗性志贺氏菌双价(S.flexneri 2a 和S.dysenteriae I)疫苗候选株DOM3,并发现其毒力减低。为了评价其残余毒力、免疫原性和保护效果,并为今后的安全性和免疫原性志愿者试验及进一步改进疫苗提供依据,我们进行了有关的动物试验。

材料与方法

  1. 动物来源:由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所动物室提供合格动物。昆明系小鼠, 3~4周龄, 14~16g; 豚鼠300g; 新西兰家兔, 雄性, 2kg。无特定病原体(specific pathogen free , SPF)BALB/c小鼠,购自中国药品生物制品检定所, 14~16克, 雌雄各半, 随机分组, 雌雄分盒饲养。

  2.菌种来源与主要特征: 菌种为本室保存,其主要特征见表1。

表1 菌种主要特征

  Table 1. Characteristics of strains

Strains Characteristics
S.flexneri 2a 301 Wildtype
S.dysenteriae I 112 Wildtype
DOM1 S.flexneri 2a 301,△aroC:CFA/I
DOM2 DOM1, △thyA
DOM3 DOM2(pYXY2,expressing S.dysenteriae I LPS)
E.coli LE392 Reference strain

  3.LD50的测定:小鼠雌雄各半, 随机分为5组, 每组5只, 用5%胃膜素配制成不同梯度菌浓度, 腹腔注射菌液0.1ml, 观察3日, 计算LD50。同时对菌液进行10倍连续稀释, 取适当的3个梯度, 每个梯度涂3个平皿, 其活菌数的均数作为活菌计数结果, 计算LD50时以实际活菌数为依据。

  4.细菌的培养:疫苗候选株DOM3和E.coli LE392用LB液体培养基,野生型毒株S.flexneri 2a 301和S.dysenteriae I 112用PA液体培养基,于摇床中37℃、160r/min培养过夜, 次日50倍稀释继续培养2~3小时,测A540值(吸光度值,原为光密度OD值),根椐A540值(0.3~0.5)与活菌计数曲线, 计算活菌浓度。收集菌体,用生理盐水洗3遍。用于免疫的细菌用生理盐水配制成所需要的浓度, 用于攻毒的细菌以5%胃膜素配制成需要的菌浓度。

  5.家兔免疫血清制备:热杀死疫苗候选株DOM3、野生型毒株 S.flexneri 2a 301和 S.dysenteriae I 112的菌浓度109CFU/ml,先经皮下注射0.1ml,然后经耳缘静脉注射,间隔5日,注射5次,注射菌液分别为0.5,1.0,1.2 ,1.5,2.0ml,最后一次耳缘静脉注射后7天测试血清中抗体滴度,注射菌液2.0ml加强免疫一次。

  6.豚鼠角膜炎试验:Sereny test按常规进行。

  7.小鼠活菌免疫程序: 通过皮下注射途径对小鼠进行免疫。疫苗候选株DOM3的皮下注射菌量108 CFU/0.1ml, 野生型毒株S.flexneri 2a 301 和S.dysenteriae I 112的菌量107 CFU/0.1ml, 对照组E.coli LE392的菌量108 CFU/0.1ml, 对照组生理盐水0.1ml;间隔时间3天, 注射3次。

  8.抗体检测方法:酶联免疫吸附试验(ELISA)。包被抗原:S.flexneri 2a 301和S.dysenteriae I 112 菌体;羊抗鼠IgA、IgM( HRP )购自Sigma 公司,羊抗鼠IgG( HRP )购自华美生物制品公司;其它按常规操作。

  9.小鼠血清中抗体的检测时间:在最后一次皮下注射疫苗候选株后的第1、2、3、4、5、6周,通过眼眶采血,每次取5~11只/组小鼠, 均测其血清中特异性抗体IgA、IgM、IgG的滴度,小鼠血清抗体滴度的几何均数,作为该组小鼠抗体的滴度。

  10.志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3对小鼠的保护效果试验:最后一次皮下注射疫苗后第14天,用野生型毒株S.flexneri 2a 301和S.dysenteriae I 112分别腹腔攻击小鼠,菌液用5%胃膜素配制, 观察3日,记录小鼠生存、死亡数, 评价保护效果。

结果

  1.志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力(毒力以LD50表示)

  (1)使用普通动物昆明系小鼠: DOM3的残余毒力LD50= 2.39×108 CFU, 野生型毒株S.flexneri 2a 301的毒力LD50=2×106 CFU, S.dysenteriae I 112的毒力LD50=4.18×106 CFU。DOM3的残余毒力比S.flexneri 2a 301低120倍, 比S.dysenteriae I 112低57倍。

  (2)使用SPF动物BALB/c小鼠: DOM3的残余毒力LD50= 5.78×107 CFU , 野生型毒株S.flexneri 2a 301的毒力 LD50=6.62×104 CFU, S.dysenteriae I 112的毒力LD50=2.95×105 CFU。DOM3的残余毒力比S.flexneri 2a 301低873倍, 比S.dysenteriae I 112低195倍。

  (3) 豚鼠角膜炎试验: DOM3的豚鼠角膜炎试验阴性,S.flexneri 2a301和S.dysenteriae I 112均阳性。阴性结果表明失去侵袭上皮细胞的能力。

  2. 志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的免疫原性

  (1)免疫后新西兰家兔血清中抗体IgG滴度: 见表2。DOM3具有双价免疫原性,具有和S.flexneri 2a 301几乎相同的免疫原性,但较S.dysenteriae I 112 的免疫原性略差。

表2 新西兰家兔血清抗体IgG滴度

  Table 2. Serum IgG titer of Newzealand rabbit inoculated by tube agglutination

Strain for

  vaccination

Serum titer for
DOM3 S.flexneri 2a 301 S.dysenteriae I 112
DOM3 20480 10240  5120
S.flexneri 2a 301  5120 10240   80
S.dysenteriae I 112  5120   80 10240

  (2)志贺氏菌疫苗候选株DOM3对小鼠的免疫原性: 经DOM3皮下注射免疫后, 小鼠血清中抗体滴度见表3。

表3 用疫苗候选株DOM3皮下免疫后小鼠血清中特异性抗体IgG、IgM、IgA滴度(几何平均数)

  Table 3. Titers of serum specific IgG,IgM and IgA of mice immunized with DOM3(geometric mean)

Antibody Week(s) after last injection
0 1 2 3 4 5 6
  IgG anti-S.flexneri 2a 2.25 519.84 905.10 452.55 149.28 85.74 49.25
    anti-S.dysenteriae I 2.25 485.03 844.49 393.97  85.74 69.64 32.49
  IgM anti-S.flexneri 2a 1.33 215.34 123.92  32.49  24.63 22.97 13.46
    anti-S.dysenteriae I 1.33 160.00  96.25  32.49  17.41 15.87 13.20
  IgA anti-S.flexneri 2a 1.33   4.02   6.71   4.60   2.55  1.61  1.58
    anti-S.dysenteriae I 1.33   3.28   5.22   3.36   1.62  1.52  1.50

  3. 疫苗候选株DOM3对野生型毒株保护力

  (1)用普通动物昆明系小鼠做试验: 经DOM3免疫的小鼠,对以30 LD50(6.13×107 CFU)野生型毒株S.flexneri 2a 301腹腔攻击的保护率为90%; 对以21 LD50(6.26×107 CFU)S.dysenteriae I 112腹腔攻击的保护率为70%; 而生理盐水组均为0, 对照E.coli LE392组保护率分别为20%和10%。DOM3组与对照组差异具有显著性(P<0.05), 见表4。

表4 疫苗候选株DOM3对普通昆明系健康小鼠的保护力

  Table 4. Protection towards Kunming mice immunized with DOM3

Strain for vaccination Challenge strains Dose(LD50) No.dead No.survive P value
S.flexneri 2a 301 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

30

  21

0

  9

10

  1

<0.05*

  >0.05*

S.dysenteriae I 112 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

30

  21

8

  1

2

  9

>0.05*

  <0.05*

DOM3 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

30

  21

1

  3

9

  7

<0.05**

  <0.05**

E.coli LE392 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

30

  21

8

  8

2

  2

>0.05*

  >0.05*

NS S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

30

  21

10

  10

0

  0

  *P value:compared with NS group,χ2 test;**P value:compared with control group of NS and E.coli,χ2 test

  (2)用SPF BALB/c小鼠做实验:经DOM3免疫后的小鼠,对以20LD50(1.38×106CFU)野生型毒株S.flexneri 2a 301腹腔攻击的保护率为100%;对以23LD50(6.95×106CFU)野生型毒株S.dysenteriae I 112腹腔攻击的保护率为80%;而对照组E.coli LE392保护率分别为10%和10%,生理盐水组均为0,疫苗候选株DOM3组与对照组差异具有显著性(P<0.05),见表5。

  表5 疫苗候选株DOM3对SPF BALB/c健康小鼠的保护力试验结果

  Table 5. Protection towards SPF BALB/c mice immunized with DOM3

Strain for vaccination Challenge strains Dose(LD50) No. dead No.survive P value
S.flexneri 2a 301 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

20

  23

0

  9

10

  1

<0.05*

  >0.05*

S.dysenteriae I 112 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

20

  23

8

  1

2

  9

>0.05*

  <0.05*

DOM3 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

20

  23

0

  2

10

  8

<0.05**

  <0.05**

E.coli LE392 S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

20

  23

9

  9

1

  1

>0.05*

  >0.05*

NS S.flexneri 2a 301

  S.dysenteriae I 112

20

  23

10

  10

0

  0

  *P value:compared with NS group,χ2 test;**P value:DOM3 group compared with control group of NS and E.coli,χ2 test

讨论

  研究表明,志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力明显低于野生型毒株。使用普通动物昆明系小鼠和SPF BALB/c小鼠的LD50实验同时证明,疫苗候选株DOM3的残余毒力比野生毒株S.flexneri 2a 301低120倍(普通昆明系小鼠)和低873倍(SPF BALB/c小鼠),比 S.dysenteriae I 112低57倍(普通昆明系小鼠)和低195倍(SPF BALB/c小鼠)。豚鼠角膜结膜炎试验证明志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3无侵袭上皮细胞的毒力。从新西兰家兔血清中特异性抗体IgG滴度可以看出,疫苗候选株DOM3具有和S.flexneri 2a 301几乎相同的免疫原性,但较 S.dysenteriaeI 112的免疫原性略差。小鼠血清中特异性抗体IgA、IgG滴度峰值出现在最后一次皮下注射的第2周,而IgM滴度峰值出现在第1周,然后血清逐步下降,约在最后一次皮下注射疫苗6周后,趋于稳定。小鼠血清中同时具有抗S.flexneri 2a菌和抗 S.dysenteriae I菌的特异性抗体,且其滴度变化的趋势基本一致。以上结果表明志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3具有良好的双价性。至于疫苗候选株DOM3较 S.dysenteriae I 的免疫原性略差,与疫苗候选株DOM3本身的特点有关。使用普通动物昆明系小鼠,经皮下注射免疫后,对以30LD50(6.13×107CFU)S.flexneri 2a 301 腹腔攻击保护率为90%,对以21LD50(6.26×107CFU) S.dysenteriae I 112腹腔攻击的保护率为70%;使用SPF BALB/c小鼠,经皮下注射免疫后,对以20LD50(1.38×106CFU)S.flexneri 2a 301腹腔攻击的保护率为100%;对以23LD50(6.95×106CFU) S.dysenteriae I 112腹腔攻击的保护率为80%。结果表明,疫苗候选株DOM3具有良好的双价保护效果。

  综上所述,动物试验证明DOM3是一株有希望的志贺氏菌双价疫苗候选株,并为今后的安全性和免疫原性志愿者试验及疫苗改进提供了依据。

  本课题受国家863项目资助(项目号:102-07-03-06)

  参考文献

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  7 余秀军,阎世德,徐建国.福氏2a志贺氏菌以thyA基因为基础的质粒染色体致死平衡系统的构建.中华流行病学杂志,1994,15(6-A)∶37-45.

(收稿:1998-01-09  修回:1998-05-26)


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