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TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21

摘要: TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白 中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 细胞因子 作者:曾劲杨李卓娅龚非力徐勇熊平 单位:430030 武汉,同济医科大学免疫学教研室 关键词:肿瘤坏死因子。信号肽类 【 摘要 】目的拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型TNFα(S-TNF-α)的产生......


TNF-α的合成分泌机制不同于一般的分泌型蛋白

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 细胞因子

作者:曾劲杨 李卓娅 龚非力 徐勇 熊平

单位:430030 武汉,同济医科大学免疫学教研室

关键词:肿瘤坏死因子;体外转录翻译系统;信号肽类

  【 摘要 】 目的 拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型TNFα(S-TNF-α)的产生机制及S-TNF-α和跨膜型TNFα(TM-TNF-α)的关系。方法 首先将分子量为17×103 S-TNF(不含编码TNF信号肽的基因)、26×103 TM-TNF(含信号肽基因)和17×103 S-TNF突变体(S-TNFm,用IL-2信号肽密码子置换TNF信号肽序列)的全长cDNA片段分别亚克隆于含T7启动子的pGEM-3Zf载体,然后利用体外转录翻译系统,在微粒体膜存在和不存在的情况下,体外翻译合成S-TNF、TM-TNF及其S-TNFm。结果 经Western blot 分析结果表明:微粒体的存在并不改变26×103 TM-TNF的分子量,但微粒体的存在能将S-TNFm上的IL-2信号肽切除,证实TNF引导序列与一般分泌性蛋白的“信号肽”不同,在粗面内质网翻译过程中不被切除。进一步酶切分析表明TM-TNF是通过某些金属蛋白酶酶解作用而被转换成S-TNF的。结论 实验结果提示17×103 S-TNF产生机制可能是:TNF产生细胞经LPS等激活后,导致TNF基因转录翻译增加,首先形成26×103 TNF,并借助其信号肽疏水氨基酸部分将之“锚定”在细胞膜,成为跨膜型TNF,介导细胞与细胞之间的生物学效应;在某些蛋白酶作用下,可将mTNF的“信号肽”切除,产生17×103分泌型TNF,释放至体液中,在局部或全身发挥作用。

  The differences between mechanisms of TNF-α synthesis and secretion and typical secretory protein ZENG Jinyang, LI Zhuoya, GONG Feili,et al.Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030

  【 Abstract 】 Objective Activated monocytes/macrophages may express two different molecular forms of TNF-α, a secretory 17kD form S-TNF-α and a tansmembrane 26kD form TM-TNF-α. It is however still a matter in dispute whether 26kD TNF is present as an integrated protein on the cell membrane.The present study is to explore the mechanisms underlying the production of S-TNF-α and the interrelation between these two forms of TNF-α.Methods Full length cDNA fragment of S-TNF(without genes encoding TNF signal peptide), 26kD TM-TNF(with gene encoding signal peptide) and S-TNF mutant(S-TNFm, in which TNF signal peptide sequence had been displaced by that of IL-2) were subcloned respectively into the vector pGEM-3Zf containing a T7 promoter, respectively. S-TNF, TM-TNF and S-TNFm were then in vitro translated and synthesized in the presence or absence of microsomes.Results As shown in Western blot analysis, the presence of microsomes did not alter the molecular weight of TM-TNF , but it did result in the cleavage of the IL-2 signal peptide from S-TNFm,suggesting that the leader sequence of TNF might differ from the signal peptide of typical secretory protein in that it seemed not to have undergone cleavage during translation in the rough-faced endoplasmic reticulum. Further enzymatic analysis revealed that TM-TNF was converted into S-TNF through the effect of certain metalloproteinase.Conclusions These results suggest that the mechanisms of TNF-α production may be as follows: Activation of TNF-α producing cells by LPS leads to augmented transcription/translation of TNF-α gene, resulting firstly in the formation of 26kD TNF-α , which is then anchored to the cell membrane as a protein with the aid of the hydrophobic amino acids of its signal peptide. This transmembrane TNF-α serves to mediate biological activities through direct cell-to-cell contact. Under the action of certain proteinase, signal peptide of TNF may be cleaved from the TM-TNF, resulting in the formation of 17kD secretory TNF-α,which is released into the body fluids, exerting its effect locally or systemically.

  【 Subject words】 TNF-α  in vitro transcription  in vitro translation  Signal peptide

  激活的单核/巨噬细胞能表达分泌型相对分子质量(17×103)及跨膜型相对分子质量(26×103)TNF-α〔1〕,但对于26×103 TNF是否以完整跨膜蛋白形式存在于细胞膜上还存在争议。Peck等认为该蛋白可能是一种外周膜蛋白,而非镶嵌膜蛋白〔2〕。Krigler等提出TM-TNF是S-TNF的前体〔3〕。这是否表明S-TNF同其它分泌型蛋白一样,在蛋白合成中其前体的信号肽在内质网被切除,继而成为成熟蛋白分泌至胞外。为了探讨这个问题,我们借助微粒体膜和体外翻译系统来研究S-TNF的产生机制及两型TNF的关系。

  材料与方法

  1. 质粒、菌株: 质粒pGEM-3Zf购自美国Promega公司; 重组质粒pBSK-S-TNF(仅包含编码无“信号肽”的TNF结构基因序列),pBSK-TM-TNF(含编码TNF结构蛋白的基因序列,包括“信号肽”), pBSK-S-TNFm(将IL-2信号肽置换TNF-α引导序列的重组突变体)均由本实验室构建。大肠杆菌 E.coli JM109由本校实验中心分子生物学教研室提供。

  2. 化学试剂及酶类: 体外转录系统、体外翻译系统、非同位素体外翻译检测系统、T4 DNA连接酶、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、 限制性内切酶(美国Promega公司);犬胰腺微粒体,m7G(5')ppp(5')G(德国Boehringer Mannheim公司);IPTG、X-gal、RNase、MTT、硝酸纤维素膜(美国Sigma公司);重组TNF标准品、抗TNF单抗、辣根过氧酶标抗体(北京邦定公司)。

  3.体外表达重组质粒的构建:碱变性法小量抽提pBSK-S-TNF、pBSK-TM-TNF、pBSK-S-TNFm三种重组质粒, 经Hind Ⅲ/BamH Ⅰ双酶切,从琼脂糖凝胶中回收纯化3种TNF cDNA片段,方法参照文献〔4〕,分别与载体pGEM-3Zf/Hind Ⅲ,BamH Ⅰ连接,并转化至大肠杆菌JM109,在含有 Amp及X-gal/IPTG的LB琼脂平板上,选择带有外源基因的白色转化菌落,得到pGEM-3Zf-S-TNF、pGEM-3Zf-TM-TNF, pGEM-3Zf-S-TNFm三种重组质粒。

  4. pGEM-3Zf-TNF重组质粒的体外转录: 用内切酶Hind Ⅲ将pGEM-3Zf-S-TNF、pGEM-3Zf-TM-TNF, pGEM-3Zf-S-TNFm三种重组质粒线性化, 按照体外转录系统试剂盒说明书操作,在T7 RNA 聚合酶的作用下将质粒DNA体外转录成带帽mRNA。

  5. 体外翻译合成TNF蛋白: 按兔网织红细胞裂解物体外翻译试剂盒操作指南进行体外翻译,并用tRNAnscendTM tRNA作为体外翻译合成特异性蛋白产物的标记物,分别在犬胰腺微粒体存在和不存在的条件下体外合成TNF。设β-内酰胺酶mRNA的体外翻译系统作为对照。

  6. 体外翻译产物的Western-blot分析: 取适当体外翻译产物进行15% SDS-PAGE;然后采用半干电转移法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上;借助非同位素体外翻译检测系统,通过显色反应鉴定出体外翻译的特异性产物。

  结 果

  1. TNF cDNA的鉴定: 为证实三种重组质粒中包含有相应的TNF cDNA片段,分别用扩增S-TNF,S-TNFm和TM-TNF的专一性引物对重组质粒进行PCR扩增,PCR扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果如图1所示。可见三型TNF cDNA条带清晰。S-TNF cDNA片段最小,为480bp;TM-TNF cDNA片段最大,为718bp;S-TNFm cDNA条带位于515bp之后,并滞后于S-TNF。说明三种TNF cDNA片段均与理论值一致。然后以这三种重组质粒为模板,经线性化处理后在T7 RNA 聚合酶的作用下,分别转录出3种类型的加帽TNF mRNA片段。

      图1 S-TNF,S-TNFm, TM-TNF PCR扩增产物电泳分析图谱

  Fig 1. 0.8% electrophoresis analysis about PCR specific products of different types of TNF

  1. λDNA/Hind Ⅲ +EcoR Ⅰ marker, 2. PCR marker, 3.S-TNF PCR products, 4. S-TNFm PCR products,5. TM-TNF PCR products

  2.在体外翻译系统中表达TNF蛋白: 采用兔网织红细胞体外翻译系统,在有或无犬胰腺微粒体膜存在的条件下,分别在体外翻译合成TM-TNF、S-TNF及S-TNF突变体,并以β-内酰胺酶(β-lactamase) 与微粒体膜共翻译产物作为对照。

  通过ELISA、生物学活性检测及TNF-α单抗阻断分析,证实体外翻译产物为具有生物学活性的TNF-α(结果略)。进一步通过Western blot分析,结果如图2。在无微粒体存在下β-内酰胺酶翻译产物仅在约31×103处有一条带(泳道2),此为内酰胺酶前体蛋白,而有微粒体存在的翻译产物,除在31×103处有一浅带外,可见一条相对分子质量较小的片段约28×103(泳道3),表明内酰胺酶前体在与微粒体的共翻译中,其信号肽脱落,降解为成熟肽。比较微粒体存在和不存在的体外翻译产物TM-TNF的相对分子质量(泳道4,5),可见它们均在同一位置上(约26×103),未见其它条带。上述结果提示,微粒体的共翻译并不影响TM-TNF的相对分子质量。但比较被置换IL-2信号肽的S-TNFm(泳道6,7),可见无微粒体存在下合成的S-TNFm,其相对分子质量约为(21~22)×103,而有微粒体存在下合成的S-TNFm则与S-TNF翻译产物及TNF标准蛋白位置一致,即泳道8相对分子质量为17×103,说明S-TNFm在微粒体的协同翻译过程中伴有相对分子质量的改变。

  图2 体外翻译产物Wsetern blot分析

  Fig 2. Western blot analysis of in vitro translation products

  1. Protein marker (97.4×103, 66.2×103, 42.7×103, 31×103, 14.4×103),2. β-lactamase,3. β-lactamase + microsome,4. TM-TNF, 5. TM-TNF + microsome,6. S- TNFm, 7. S- TNFm + microsome,8. S-TNF

  3. 体外合成26×103 TNF的酶解分析:将体外翻译产物26×103 TNF与胶原酶(1μg/1μgDNA)和胰蛋白酶(2μg/1μgDNA)在37℃孵育2小时,用其反应混合物进行Western blot分析。结果如图3,泳道2是未酶切的TNF,其相对分子质量为26×103, 泳道3是胶原酶处理的蛋白产物,可见体外合成26×103 TNF蛋白被酶解为17×103分泌型蛋白分子;同样体外翻译蛋白经胰蛋白酶作用后被分解成2个约16×103和13.5×103的小片段(泳道4)。

图3 经蛋白酶处理的TM-TNF体外翻译产物Western blot分析

  Fig 3. Western blot analysis of in vitro translation products TM-TNF treated with proteinase

  1. protein Marker, 2. TM-TNF,3. TM-TNF + collagenase, 4. TM-TNF + trypsin, 5. S-TNF

  讨 论

  内质网是细胞内多种重要蛋白质合成的基地。微粒体(microsome)是由粗面内质网断裂构成的许多封闭小泡,但仍保留粗面内质网所具有的蛋白质合成、糖基化和切除分泌蛋白上信号肽等功能〔5〕。因此,在体外翻译系统中,可借助微粒体膜来研究分泌型蛋白的合成、分泌机制。本实验利用体外转录翻译系统,特异地在微粒体膜上翻译表达TNF蛋白分子,以探讨其合成和分泌机制。

  细胞内仅部分蛋白质是直接在细胞质基质中合成成熟蛋白分子,然后再转运至相应的细胞器中。而多数蛋白质则是采用“共转移” 方式完成蛋白合成,即先在细胞质基质中合成N端含一段信号肽序列的多肽链,该信号肽引导核糖体与内质网膜结合;然后信号肽穿入内质网膜并引导肽链进入内质网腔中,同时信号肽被内质网膜内表面的信号肽酶切除,多肽合成继续进行直至完成。若合成的多肽全部进入内质网腔中,则形成分泌型蛋白;但如果合成的多肽分子中含有停止转移序列,则合成的多肽最终成为跨膜蛋白〔5〕。β-内酰胺酶是一个典型的分泌型蛋白, 在微粒体膜存在的体外翻译系统中,由于其信号肽能被微粒体膜上的信号肽酶切除,导致蛋白相对分子质量由31×103降低为28×103(图2)。

  过去认为,17×103分泌型TNF也是通过这类机制分泌的。但Krigler等提出26×103 TNF可能是17×103 TNF的前体, 而26×103 TNF又是一个跨膜蛋白分子〔3〕,提示TNF的合成分泌机制可能与其它分泌型蛋白不同。本实验借助体外翻译转录系统和Western blot技术,观察比较微粒体膜存在及不存在的情况下体外翻译合成的26×103 TNF分子量的改变。结果表明,微粒体膜的存在并不能改变26×103 TNF的相对分子质量。是否说明TNF蛋白的合成不需要在内质网中进行?用典型分泌型蛋白IL-2的信号肽基因置换26×103 TNF的信号肽构建成S-TNFm,拟将TNF合成机制改变成典型分泌型蛋白合成机制,结果显示该突变体在微粒体存在条件下进行体外翻译合成,其相对分子质量减少约4×103(图2),近似IL-2信号肽的分子量,提示其信号肽被切除。真核细胞表达实验也证实S-TNFm仅指导产生分泌型TNF, 而不指导合成跨膜型TNF。这提示TNF同多数蛋白一样,也需要信号肽指导到粗面内质网上完成蛋白合成, 但TNF合成分泌机制又与多数分泌型蛋白不同。分泌型蛋白的信号肽大多由20~25个氨基酸组成,但TNF则含有一个超长的、由76个氨基酸组成的“信号肽”, 它在翻译合成过程中不被微粒体膜内的信号肽酶切除,可能既有信号引导功能,又含有停止转移序列,能作为TNF跨膜单位,形成26×103 TNF跨膜蛋白。

  那么26×103 TNF跨膜蛋白又是如何转换成17×103分泌型蛋白?已有研究表明,两型TNF的转换可能与体内某些丝氨酸蛋白酶类或金属蛋白酶类有关〔6,7〕。本实验选择胶原酶(属真核生物基质金属蛋白酶类)和胰蛋白酶(属细菌性金属蛋白酶)分别处理体外合成的26×103 TNF及S-TNF突变体。结果表明,只有胶原蛋白酶能将26×103 TNF前体降解成17×103 TNF分子,而胰蛋白酶则是非特异性降解。 从而提示,17×103分泌型TNF的合成分泌机制与一般的分泌型蛋白不同,是由跨膜TNF经某些蛋白酶的裂解,脱落成分泌型蛋白。可能机制是TNF首先在游离核糖体上合成含一段“信号肽”,该“信号肽”引导核糖体与内质网结合;使整个蛋白分子继续翻译合成,而其“信号肽”却不被信号肽酶切除;蛋白分子继而在高尔基复合体参与下转运至胞膜,并以跨膜形式表达于细胞表面,成为镶嵌在细胞膜上的26×103 TNF跨膜分子,然后在某些蛋白酶作用下被水解,与“信号肽”部分分离,产生17×103分泌型TNF,进一步释放至体液中。

  本科题为国家科学基金资助项目,批准号:39270314

  参考文献

  [1]Especik T J. Nissen-meyer tumor necrosis factor-like activity on para-formal-dhyde-fixed monocyte monolayers. Immunol, 1987,61∶443-448.

  [2]Peck R, Brockhaus M, Frey JR, et al. The principal tumor necrosis factor recepter in monocyte cytotoxicity is on the effector cell,not on the target cell. Cell Immunol, 1991,132(2)∶308-312.

  [3]Kriegler M, Perez C, Defay K, et al. A novel form of TNF/cachectinis a cell surface cytotoxic transmembrane protein: remification for the complex physiology of TNF. Cell, 1988, 53∶45-53.

  [4]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.第一版,北京:高等教育出版社,1993,342.

  [5]瞿中和主编.细胞生物学.第一版,北京:高等教育出版社,1995,102.

  [6]Gearing AJH, Beckett P, Christodoulou M, et al. Processing of TNF-α precursor by metalloproteinase. Nature, 1997,370∶ 555-557.

  [7]Gerard M, McGeehan J, David Secherer, et al. Regulation of TNF-α processing by a metalloproteinases inhibitor. Nature,1994,370∶558-559.

(收稿:1997-11-24  修回:1998-02-20)



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