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活化淋巴细胞及其染色质诱导抗核抗体生成

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:风清扬 2009-2-21
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摘要: 活化淋巴细胞及其染色质诱导抗核抗体生成 中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 基础免疫学 作者:卢琳奚华国吴厚生 单位:200032 上海医科大学免疫学教研室 关键词:淋巴细胞。抗体。抗核 【 摘要 】目的 诱导抗双链DNA抗体和其它抗核抗体生成的免疫原是什么。本研究试图阐明不同原因活化的淋巴细......


活化淋巴细胞及其染色质诱导抗核抗体生成

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 基础免疫学

作者:卢琳 奚华国 吴厚生

单位:200032 上海医科大学免疫学教研室

关键词:淋巴细胞;染色质;抗体;抗核

  【 摘要 】 目的  诱导抗双链DNA抗体和其它抗核抗体生成的免疫原是什么?迄今不明。本研究试图阐明不同原因活化的淋巴细胞是诱导抗核抗体生成的免疫原。方法 用丝裂原(Con A/LPS)或IL-2活化淋巴细胞及其染色质免疫同系BALB/c小鼠,用ELISA测定IgG抗dsDNA抗体,用免疫荧光法检测抗核抗体核型和免疫复合物沉积,用免疫印迹法测定抗Sm和抗RNP等抗核抗体。结果 上述原因活化的淋巴细胞及其活性染色质均能诱导抗双链DNA抗体和其它抗核抗体生成,免疫小鼠的肾脏有显著的免疫复合物沉着。 结论  据本文结果推测活化淋巴细胞及其细胞核和染色质是诱发抗dsDNA抗体和其它抗核抗体生成的免疫原。

  Induction of antinuclear antibodies by immunization with activated lymphocytes and their active chromatin LU Lin, XI Huaguo, WU Housheng. Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

  【 Abstract 】 Objective To identify the activated lymphocytes as the antigens to induce antinuclear antibody.Methods BALB/c mice were immunized separately with syngeneic lymphocytes activated by mitogen(Con A/LPS) or IL-2, and with nuclei or chromatin isolated from the activated lymphocytes. The IgG anti-dsDNA antibodies were detected by ELISA, anti-nuclear antibodies and immune complex in glomeruli were observed by immunofluorescent stain, anti-Sm and anti-RNP antibodies were determined by immunoblot assay.Results Anti-dsDNA antibodies and other antinuclear antibodies were induced by lymphocytes activated by Con A/LPS or IL-2 or by active nuclei and chromatin. Anti-DNA antibody positive mice had marked immune complex deposits in glomeruli.Conclusion Our results suggest that activated lymphocytes and their nuclei and chromatin could be the immunogens driving production of the anti-dsDNA autoantibodies and other antinuclear antibodies.

  【 Subject words 】 Activated lymphocytes  Chromatin  Antinuclear antibodies

  以抗dsDNA抗体、抗Sm抗体为代表的抗核抗体是系统性红斑狼疮(SLE)的重要血清学诊断指标,也是SLE重要的致病性抗体〔1〕。但是用相应的天然DNA和核小体免疫动物不能诱导这些抗体产生〔2,3〕,至今人们尚不知诱导这些自身抗体产生的免疫原是何种物质。

  我们在用T细胞疫苗(TCV)预防和治疗SLE的过程中发现,活化的近交系小鼠淋巴细胞作为抗原免疫同系小鼠能诱导抗dsDNA抗体的生成〔4,5〕 。对此现象我们作了深入研究,用不同因素活化的淋巴细胞及其染色质作为抗原免疫同系小鼠,并测定抗双链DNA抗体、抗可浸出核抗原(ENA)抗体,进一步探讨抗核抗体的生成机理。

  材料与方法

  1.动物:6~8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠购自中英合资西普尔-毕凯实验动物有限公司。

  2.试剂盒:ENA多肽谱试剂盒、Hep-2细胞抗核抗体核型检测试剂盒均购自上海第二医科大学仁济医院。

  3.活化淋巴细胞的制备及免疫:无菌取脾脏和肠系膜淋巴结,用Tris-NH4Cl 破坏红细胞,用完全1640培养液调整细胞浓度为2×106个/ml;分3组,每组分别加Con A(终浓度10μg/ml),LPS(终浓度10μg/ml),IL-2(终浓度1000U/ml),于37℃,5%CO2培养72小时,分别经过或不经过0.3%戊二醛处理,按2×107细胞/鼠皮下注射,每周1次,计3次。

  4.活性细胞核及其染色质的提取和免疫:按改良Chiu法〔6〕, 活性细胞核及其染色质从Con A活化的脾细胞中提取,静止细胞核及其染色质从未活化的脾细胞中提取。分别按2×107个核/鼠、50μg染色质/鼠皮下注射,每周1次,计3次。3次免疫后眶后静脉丛采血样,并分离血清。

  5.IgG类抗双链DNA抗体检测〔7〕用ELISA方法检测IgG类抗dsDNA抗体生成。酶标板用0.5%硫酸鱼精蛋白预处理。S1核酸酶处理小牛胸腺DNA,按50μg/ml作为包被抗原。血清样品按1∶50稀释。

  6.ENA多肽谱的检测:采用Western blot法,基本操作按试剂盒说明书进行。

  7.Hep-2细胞抗核抗体荧光核型的检测:采用间接免疫荧光法,基本操作根据试剂盒说明书进行。

  8.肾脏免疫病理检测:取小鼠肾脏做冰冻切片,用羊抗小鼠IgG荧光抗体染色(直接免疫荧光法)检测肾小球IgG类免疫复合物沉积。

  结 果

  1.活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成:正常鼠和以未活化淋巴细胞免疫的小鼠没有1例出现IgG类抗dsDNA抗体; 而经ConA激活的T淋巴细胞、经LPS激活的B淋巴细胞及IL-2活化的LAK细胞免疫的小鼠均检测到高滴度IgG类抗dsDNA抗体生成,按吸光度(A)值≥正常(A)值+3s为阳性,则阳性率为100%(17/17),见表1。

表1 活化的淋巴细胞诱导IgG类抗dsDNA抗体生成

  Table 1. Induction of anti-dsDNA IgG antibody by immunization with activated lymphocytes

 Antigen

  source

Number

  of mice

Anti-dsDNA

  antibodies

  A(

Anti-dsDNA

  antibodies

  positive rate

 1 Control 6 0.049±0.025 -
 2 Resting spleen

  cells

5 0.074±0.029 0/5
 3 Spleen cells

  activated

  with ConA

6 1.134±0.223 6/6
 4 Spleen cells

  with LPS

  activated

5 0.995±0.309 5/5
 5 Spleen cells

  with IL-2

  activated

6 0.758±0.309 6/6

  2. 活性细胞核及活性染色质诱导IgG类抗dsDNA抗体生成:如表2所示,经活性细胞核免疫的小鼠及经活性染色质免疫的小鼠均检测到IgG类抗dsDNA抗体生成,按A值≥正常A值+3s为阳性,则阳性率为100%(10/10)。静止细胞核免疫和静止染色质免疫的小鼠没有1例出现IgG类抗dsDNA抗体。结果提示,活化淋巴细胞的核及染色质可能是活化淋巴细胞免疫小鼠产生DNA抗体中的有效免疫原。

表2 活性细胞核及活性染色质诱导IgG类抗dsDNA抗体生成

  Table 2. Induction of anti-dsDNA IgG antibody by immunization with active nuclei or active chromatin

Antigen

  source

Number

  of mice

Anti-dsDNA

  antibodies

  A(

  (Preimmu-

  nization)

Anti-dsDNA

  antibodies

  A(

  (Postimmu-

  nization)

Anti-dsDNA

  antibodies

  positive rate

1 Resting cell

  nuclei

6 0.045±0.029   0.068±0.038 0/5
2 Active cell

  nuclei

5 0.029±0.029 0.472±0 5/5
3 Resting

  chromatin

6 0.064±0.032   0.089±0.034 0/6
4 Active

  chromatin

5 0.058±0.017   0.412±0.100 5/5

  3. 活化淋巴细胞及其活性核物质诱导的抗核抗体的荧光核型:用Hep-2细胞检测活化淋巴细胞及其活性核物质诱导的抗核抗体的荧光核型,结果如下:所有免疫血清均抗核抗体(antinuclear antibodies, ANA)阳性,IL-2活化LAK细胞免疫组以周边型为主;活性细胞核免疫组、活性染色质免疫组呈周边型和均质型;而LPS活化B淋巴细胞免疫组、Con A活化T淋巴细胞免疫组呈周边型、均质型和细颗粒型,即多种核型阳性。

  4. ENA多肽谱检测结果:用Western blot法检测了ANA呈颗粒型7个免疫血清样品,结果显示:有1个样品在分子质量为28×103、29×103、32×103处有显色区带,即抗RNP抗体阳性;有1个样品在13.5×103、17.5×103、28×103、29×103、32×103处有显色区带,即抗RNP、抗Sm抗体阳性;有5个样品在(52~73)×103之间有显色区带,可能是55×103的抗Jo-1抗体。

  5. 肾脏免疫病理的变化:对IgG类抗dsDNA抗体阳性的小鼠,用直接免疫荧光法可以检测到小鼠肾脏有IgG类免疫复合物沉积,呈斑块状(见图1)。IgG类抗dsDNA抗体阴性的小鼠则未见有肾内IgG类免疫复合物沉积。

图1 IgG类抗dsDNA抗体阳性小鼠肾小球免疫复合物荧光(40×)

  Fig 1. Fluoresence of immune complex deposits in glomerulus of mice with anti-dsDNA antibody in serum

  讨 论

  抗核抗体是SLE患者的致病性抗体和血清学诊断指标。但是人们尚不能在正常小鼠中诱发这些抗核抗体的产生。由于单纯的DNA是没有免疫原性的,有人提出染色质(DNA和蛋白质的复合物)是诱生抗dsDNA抗体的自身抗原〔8〕,但未能获得直接实验证据,因为用正常染色质尚不能诱生抗dsDNA抗体。用核小体免疫自身免疫狼疮鼠能加重狼疮性肾炎,但不能在正常鼠中诱发肾炎〔3,9〕

  我们用不同原因活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原,免疫同系小鼠,结果成功地诱导产生了IgG类抗dsDNA抗体,这种诱生抗体的能力不受活化淋巴细胞免疫注射前化学处理(戊二醛灭活)的影响〔4,5〕。本文的研究表明,从活化淋巴细胞中提取的活性细胞核及活性染色质就足以诱导产生IgG类抗dsDNA抗体,进而发现活化的淋巴细胞免疫还可诱导产生抗Sm、抗RNP等多种抗核抗体,而未活化淋巴细胞及其静止细胞核、静止染色质则不能。据这一现象推测,活化淋巴细胞的核成分可能是诱生包括抗dsDNA抗体在内的多种抗核抗体的真正自身免疫原。

  人们早已观察到感染、遗传因素、性激素不平衡和免疫调节紊乱以及Fas和Fas配体异常等易诱发SLE〔10〕,但是不能很好地解释这些不同原因是如何诱导抗核抗体生成的。我们的实验提出SLE发病学的共同道路可能是淋巴细胞活化引起核免疫原的变化,诱导自身抗核抗体的生成。

  正常机体对未活化的静止核抗原呈耐受状态。我们推测,细胞活化时核免疫原发生变化,可能表达新的抗原决定簇或隐蔽抗原决定簇的暴露,激活TH ,打破自身T细胞耐受,从而辅助具有应答潜能的识别核抗原的B细胞产生抗体。上述内因与外因均能活化淋巴细胞或使淋巴细胞易于活化。因而淋巴细胞的活化可能是SLE发病学的一个关键。尽管在正常状态下体内也有一定量的淋巴细胞的活化,但是并不是每个人都发生狼疮性疾病。什么条件下的淋巴细胞的活化才能产生上述核免疫原的变化?改变了的核免疫原又需要怎样的递呈条件才能引起有效免疫应答?活化淋巴细胞的膜免疫原发生什么变化?本实验室正在继续开展这方面的研究工作。

  本课题受国家自然科学重点基金资助(39730430)

  参考文献

  [1]Tan EM. Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol,1989, 44∶93-151.

  [2]Stollar BD. Immunochemistry of DNA. Int Rev Immunol, 1989, 5∶1-6.

  [3]Mohan C, Adams S, Stanik V, et al. Nucleosome: A major immunogen for pathogenic autoantibody-inducine T cells of lupus. J Exp Med,1993, 177∶1367-1381.

  [4]卢琳,李金柱,吴厚生,等.促丝裂原活化淋巴细胞诱导抗双链DNA抗体.上海医科大学学报,1997,25(4)∶250-253.

  [5]李金柱,王美英,吴厚生.T细胞接种对SLE样小鼠防治作用的探讨.上海免疫学杂志,1997,17(3)∶164-167.

  [6]钟叔平,何开玲.SRS-淋巴瘤小鼠淋巴细胞染色质理化性质的研究.中国病理生理杂志,1994,10(4)∶378-381.

  [7]夏金华,吴厚生.天然DNA和细胞因子对系统性红斑狼疮患者淋巴细胞体外分泌抗双链DNA抗体的影响.上海医科大学学报,1994,21(2)∶109-114.

  [8]Theofilopoulos AN. The basis of autoimmunity part I: aberrant self recognition. Immunol Today,1995, 16∶90-98.

  [9]Rumore P, Steinman C. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus: Occurrences as multimeric complexes bound to histones. J Clin Invest, 1990, 86∶69-74.

  [10]Steingberg AD. Insights into the basis of systemic lupus. J Autoimmun, 1995, 8∶771-785.

(收稿:1997-07-28  修回:1998-04-18)



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