利用细菌鉴定卡保存菌种

　　微生物实验室成功地进行细菌菌种保存，对于系统地分析流行菌株的生物学、分子生物学特征和耐药性的变迁，以及对医院感染病原学调查、新药临床研究都十分重要［1］。我们通过对1998年1月～2000年5月两年多时间冰冻保存的VITEK-GNI、GPI、YBC 3种生化鉴定卡共4 700株常见的细菌，选择其中258株常见进行复活再鉴定，以探讨操作简便而又实用可靠的保存临床标本分离细菌菌株的方法，现报道如下。

　　一、材料和方法

　　1.标本来源：258株1998年1月～2000年5月从痰、血、尿、脓液等标本中分离、纯培养的细菌，用VITEK全自动微生物分析仪分析后，其GNI、GPI、YBC生化卡当日即按流水号顺序置-20 ℃冰箱保存。

　　2.仪器：VITEK全自动微生物分析仪及配套生化卡、药敏卡。生物梅里埃公司。

　　3.方法：把3种鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸出阳性生长孔内的液体，点种于血平板或沙保弱平板，置35℃孵箱内24～48 h复苏。复苏菌落经分离培养后，用VITEK系统对菌株进行鉴定和药敏试验，以金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、绿脓假单胞菌ATCC27853作质控。

　　二、结果

　　1.菌株复活率：258株细菌按初始鉴定的结果，以伯杰细菌分类为依据，归纳为葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌科、肠球菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、不动杆菌属、念珠菌属8大类。各类菌属的细菌100%的存活时间：葡萄球菌属、肠杆菌属、念珠菌属为29月，肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属为21个月，链球菌属和假单胞菌属为10个月。

　　2.生物学特性及耐药谱变化：258株细菌中共218株复活成功，复活菌株的培养特点、形态特征、生化特性均与初始鉴定结果一致，细菌的冻融复活前后药敏谱也基本一致，符合率为93.7%～100%。

　　3.反复冻融的影响：从复活的各类菌株中选取30株的生化卡反复冻融5次，每次冰冻的时间保持24 h以上。结果30株细菌5次冻融均复活成功，且其生物学特性及耐药谱未发生明显的变化，证实多次冻融对细菌的保存无影响。

　　4.与半固体菌种保存法的比较：用鉴定卡和半固体菌种培养基同时保存12株临床分离菌及3株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853标准菌株6个月对照，其中半固体中的菌株定时转种传代。结果两种方法保存菌株的生物学特性均一致。

　　三、讨论

　　菌株保存得不成功容易引起菌株的生物学特征改变，甚至是耐药质粒的丢失而改变细菌的耐药谱，某些敏感菌株与抗生素结合位点发生突变而形成耐药［2，3］。根据对258张VITEK生化卡的冻融复活再分析，使我们成功地找到一种利用废弃的VITEK鉴定卡作为临床分离菌株的菌种保存方法，既不需要特殊设备，又不受反复转种影响，因而其生物学特性不易发生变异，细菌的耐药谱也基本保持不变。

　　随着全自动微生物分析仪的普及应用，该方法可适合于常规工作的大量菌种保存的应用。对VITEK生化卡内的细菌反复冻融5次，分离出的细菌效果是相同的，证实保存在生化卡上的菌种可进行多次复活利用，为了保证每次都能成功地复苏获得菌株，我们通过试验发现，生化卡上的试验小孔除阳性控制小孔外，其它糖类发酵孔内的细菌均能复活成功，其结果无差异。由于快速复温对细菌的损伤力小［4］，为了保证菌株获得最大的成活率，我们认为对鉴定卡复融应采取由-20直接放35℃孵箱。

　　参考文献

　　1，张秀珍，主编. 当代细菌检验与临床. 北京：人民卫生出版社,1999. 401-446.

　　2，Chambers HF, Sachdeva MJ, Hackbarth CJ. Kinetics of pencilin binding to penicillin-binding proteins of Stophylococcus aureus. Biochem J, 1994,301:885-891.

　　3，王清涛，杜小玲，曲寿山，等. 金黄色葡萄球菌耐药性分析. 中华医学检验杂志，1997,20:275.

　　4，章崧英，王泽时，郑斯通，主编. 实用低温学. 北京：科学出版社，1994.73-77.