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单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断、治疗中的应用

来源:论文汇编 作者:自动采集 2005-1-1
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摘要: hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来,单克隆抗体技术在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛,但在疾病治疗方面,还没有达到令人满意的效果,原因主要是应用的单克隆抗体绝大多数来自鼠类,而鼠抗体在人体内应用时容易产生人抗小鼠Ig抗体而降低疗效,而人源性抗体制备尚存在许多困难。1988年以来,抗体基因工程的......



   自从1975年K?hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来,单克隆抗体技术在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛,但在疾病治疗方面,还没有达到令人满意的效果,原因主要是应用的单克隆抗体绝大多数来自鼠类,而鼠抗体在人体内应用时容易产生人抗小鼠Ig抗体而降低疗效,而人源性抗体制备尚存在许多困难。

  1988年以来,抗体基因工程的研究取得了一些技术上的进展。Huston等[1]和Bird等利用基因工程技术成功制备了单链抗体(Single chain Fv, scFv或single chain antigen binding protein, SCA),scFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断,大小为完整抗体的六分之一,分子量约为27KD。它具有许多优点:①分子小,免疫原性低,用于人体不易产生抗异种蛋白反应;②容易进入实体瘤周围的微循环;③血循环和全身廓清快,半衰期短,肾脏蓄积很少;④无Fc段,不易与具有Fc受体的非靶细胞结合,成像清晰;⑤易于基因操作和基因工程大量生产。此外单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子,单链抗体也是构建双特异性抗体的理想元件,用于肿瘤的临床诊断和治疗显示出了巨大的潜力,目前国外的一些抗肿瘤单链抗体已进入体内试验阶段。

  1 单链抗体的构建

  基因工程单链抗体技术的基本原理是:首先从杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞中提纯mRNA,再经RT-PCR分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变区编码基因,人工合成一条寡核苷酸序列(称为Linker),将VL的C端与VL的N端或VH的C端与VL的N端相连接,构建成单链抗体基因,在一定的表达系统中得以表达。

  人工合成的寡核苷酸Linker序列,在单链抗体的构建中十分重要,Linker必须能使重、轻链可变区自由折叠,使抗原结合位点处于适当的构型,并不引起分子动力学改变,目前使用最多的Linker序列是Huston根据X线晶体衍射分析抗体可变区结构的15肽序列(Gly4Ser)3[1],许多研究者应用此序列构建单链抗体基因并表达出活性产物。

  单链抗体的C末端可以引入半胱氨酸尾[2]、酪蛋白激酶底物尾[2]、E尾等结构,有助于标记和偶联其它分子,也可以引入钙调蛋白尾[2]、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾[3]、脂类标签、组氨酸尾等,使表达产物易于检测和纯化。

  2 单链抗体的表达系统

  2.1 细菌 目前,大多数单链抗体都在E.coli中表达。E.coli易于操作,转化和转导效率高,生长迅速,可以快速大规模地生产抗体蛋白。E.coli表达单链抗体主要有两种方式:①表达产物以包涵体形式存在于菌体内,这种方法简单,不需要信号肽,但产生的蛋白常常没有活性,经过体外溶解、复性、重新折叠、色谱纯化等许多步骤,才可能获得有活性的单链抗体。②分泌表达具有功能的单链抗体至细胞周质中,它避免了表达后蛋白复性的许多麻烦,近年来单链抗体的表达主要采用分泌表达方式,将引导分泌表达的信号肽OmpA、PelB、phoA等基因与单链抗体基因相连接,使表达产物分泌到细胞周质或培养上清中,获得有活性的可溶性表达产物。Kipriyanov等[4]发现,在培养基中加入终浓度为0.4M的蔗糖,可使可溶性的单链抗体产量提高15~150倍。Naveen等发现,VL和VH功能域的先后顺序对单链抗体的分泌水平影响很大。VL-VH结构的分泌产量是VL-VH结构产量的20倍。另外,轻链部分在免疫球蛋白分子的分泌调节中起重要作用,单独的轻链可以稳定分泌,单独重链则很难分泌,推测机理可能是:VH的折叠占据了VL的空缺部位,导致包涵体形成,影响了分泌量。

  随着研究的深入,人们发现利用E.coli表达抗体具有一定的局限性,因为E.coli不能对重组抗体进行翻译后糖基化修饰,但目前尚没有证据表明糖基化与抗原结合能力有直接关系。

  2.2 真核细胞 真核细胞具有一套完整的合成、组装和分泌蛋白质的细胞装置,因此产生的抗体分子与天然蛋白质一样能形成链间和链内二硫键,维持正确的蛋白构象以及翻译后糖基化加工,并分泌到细胞外,成为功能性抗体分子。目前用于表达单链抗体的真核细胞有:酵母、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。Carolina等用乳腺细胞(COS-7)表达单链抗体,分泌表达的单链抗体至少90%以上具有功能性。目前用乳腺细胞表达单链抗体应用较多。Eldin等[5]用酵母分泌表达了两种不同的单链抗体,最高水平达到250mg/L,与E.coli表达的相同单链抗体比较,抗原亲和力没有改变,是一种高产价廉的表达系统。

  2.3 噬菌体 近年来,将噬菌体表达呈现技术应用于单链抗体筛选,可从外周血淋巴细胞直接提取mRNA,绕过杂交瘤,甚至绕过免疫途径构建和筛选单链抗体基因。它的主要优点是:①利用噬菌体表达抗体一般产量高,活性强,特异性好,易于筛选;②可以构建人的抗体可变区基因全库,从而为生产人型抗体奠定了理论基础。Marlies等[6]发现通过噬菌体库得到的单链抗体与杂交瘤单链抗体比较具有产量高、肿瘤/正常组织分布比值(T/NT比值)高、肾脏摄入量低、亲和力高等优点。

  2.4 植物 在植物中表达的抗体通过称为植物抗体(plantibody)。Paraskevi等[7]在烟草中表达抗AMCV(artichoke mottled crinkle virus)病毒的单链抗体,产量达叶片总蛋白的0.1%,所有表达的抗体都有活性。在转基因植物中可以降低病毒感染率,延缓症状的出现。植物抗体的出现使农业大规模生产抗体成为可能。

  3 单链抗体在肿瘤诊断中的应用

  单链抗体用于放射性显影表现出很多优势:①能快速进入瘤体组织;②血循环和全身廓清快;③无Fc段,不易与具有Fc受体的非靶细胞结合,T/NT比值高,在肿瘤定位诊断时图像清晰。Begent等[8]用123I标记抗肿瘤相关抗原(CEA)的单链抗体应用于临床病人的显像分析,结果表明:所有已知的肿瘤部位都定位明显,优于目前应用的各种成像技术。Nieroda等报道将γ-干扰素与单链抗体同时应用,不仅可以提高肿瘤部位的信号,还可以提高T/NT比值2~4倍,明显增强显像效果。如果将γ-干扰素与单链抗体偶联在一起,将更加提高肿瘤定位的有效性。

  4 单链抗体在肿瘤治疗中的应用

  单链抗体应用于肿瘤治疗主要通过以下方式:

  4.1 重组免疫毒素是将单链抗体基因C末端与毒素基因相连,经表达后获得scFv与毒素的融合蛋白。常用的毒素有绿脓杆菌外毒素PE、蓖麻毒素、白喉毒素等[9]。Pauza等[]新近报道,通过二硫键将蓖麻毒素A与抗T细胞相关抗原CD7的单链抗体相连,重组的单链免疫毒素对CD7+Jurkat细胞蛋白合成有明显抑制作用。Goldberg等[10]将抗表皮生长因子的单链抗体EGF与PE40偶联,获得的重组毒素已用于膀胱癌病人I期临床试验。Benhar等用二硫键连接轻、重链可变区的方法制备B1(dsFv)-PE38和B3(dsFv)-PE38重组免疫毒素,在37℃稳定,可以通过腹腔内微渗透泵持续给药,治疗裸鼠体内的异种移植肿瘤,在LD5的1/20~1/30剂量下,可使50nm3的小肿瘤完全抑制;在LD50的1/11剂量时可将150~200mm3肿瘤组织完全抑制。

  4.2 另一类双功能单链抗体是将单链抗体基因与细胞因子基因相连表达的融合蛋白,常用的细胞因子有IL-2、TNF、IFN等。Itzhak等[11]在进行肿瘤基因疫苗的研究中,使用B细胞淋巴瘤38C13小鼠模型制备的scFv分别与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-1β九肽片段构建双功能单链抗体。其中IL-1β九肽片段具有完整的细胞因子和免疫激活效应,但无致热性。经实验证实scFv-IL-1β片段融合蛋白和编码此蛋白的裸露DNA都具有免疫性,能保护小鼠免受肿瘤攻击,scFv-GM-CSF融合蛋白也具有同样功能,但不能作为DNA疫苗。

  4.3 将单链抗体与药物代谢酶相连用于肿瘤治疗称“抗体导向酶-前体药物疗法(ADEPT)”,它利用抗体导向的原理,将前体药物的专一性活化酶选择性地投入到肿瘤组织部位,这样前体药物可区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子,从而发挥抗肿瘤作用。另外还可以通过旁观者效应(bystander effect)杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,扩大杀伤效应。Stephen等[12]将L6单链抗体与β内酰胺酶融合,融合产物的肿瘤亲和活性和酶活性都没有改变,被覆融合蛋白的肿瘤细胞对头孢菌素芥子前体药物敏感。

  4.4 双特异性抗体是指将抗体分子改造后生成的具有两种不同抗原结合特异性的抗体分子,它的一个臂针对靶细胞的表面抗原,另一个臂针对免疫活性细胞表面的活性分子,从而将抗体的靶向性与激活免疫细胞的杀伤功能结合起来。Mack等[13]构建的双特异性单链抗体对T细胞CD3抗原和结肠直肠癌的常用标志物17-1A抗原具有亲和活性,无论在动物实验,还是临床I期试验中都显示出较好的疗效。Cho.B.K.等[14]构建的抗T细胞受体(TCR)/叶酸盐受体的双特异性抗体,对叶酸盐受体阳性的卵巢癌及多种脑肿瘤细胞具有明显的溶解作用。

  4.5 用放射性同位素标记的单链抗体也可以用于肿瘤的治疗。Dario等[2]在抗黑色素瘤单链抗体(225.28S)末端引入酪蛋白Ⅱ底物尾,从而可用32P高效稳定的标记,用于黑色素瘤治疗。George等[15]用186Re或188Re标记对erbB-2特异的741F8-1单链抗体,用于肿瘤的放射免疫治疗。

  5 结 语

  研究显示,单链抗体在肿瘤组织的聚集总量较完整的抗体低,但应用单链抗体的双聚体或多聚体,可以提高单链抗体的浓度,发挥更加有效的肿瘤治疗作用。

参考文献

  1 Huston JS, et al. Natl Acad Sci USA, 1988;85:5879-5883

  2 Dario Neri, et al. J Invest . Dermatol, 1996;107(2):164-170

  3 Stollar B D, Methods, 1997;11(1):12-19

  4 Kipriyanov S M, et al. J Immunol Methods, 1997;200(1-2):69-77

  5 Eldin P, et al. J Immunol. Methods, 1997;201(1):67-75

  6 Verhaar M J, et al. Int. J Cancer, 1995;61(4):497-501

  7 Tavladoraki P, et al. Nature, 1993;366(6454):469-472

  8 Begent R H, et al. Nat. Med, 1996;2(9):979-984

  9 Pauza M E, et al. J Immunol, 1997;158(7):3259-3269

  10 Goldberg M R, et al. Cancer Res, 1995;1:57-61

  11 Hakim I, et al. J Immunol, 1996;157:5503-5511

  12 Stephen C, Goshorn, et al. Cancer Res, 1993;53:2123-2127

  13 Mack M, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA,1995;92(15):7021-7025

  14 Cho B. K, et al. Bioconjug. Chem, 1997;8(3):338-346

  15 George A J, et al. Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(18):8358-8362

 


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