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庆大霉素对内侧橄榄耳蜗传出神经毒性作用的形态学观察

来源:中华耳鼻咽喉科杂志 作者:谢鼎华郭运凯伍伟景杨新明贺湘波 2004-9-29
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摘要: 摘要目的:观察庆大霉素慢性耳中毒前后蒙古沙鼠内侧橄榄耳蜗(medial olivocochlear,MOC)传出神经的形态改变及其与毛细胞损害的关系,以探讨MOC传出神经在氨基糖甙类抗生素慢性耳中毒中的重要性。方法:采用改良的乙酰胆碱酯酶组化染色和甲苯胺蓝-苏木素染色法,全耳蜗铺片观察健康对照组和庆大霉素组耳蜗MOC传出神经和......


   摘要 目的:观察庆大霉素慢性耳中毒前后蒙古沙鼠内侧橄榄耳蜗(medial olivocochlear,MOC)传出神经的形态改变及其与毛细胞损害的关系,以探讨MOC传出神经在氨基糖甙类抗生素慢性耳中毒中的重要性。方法:采用改良的乙酰胆碱酯酶组化染色和甲苯胺蓝-苏木素染色法,全耳蜗铺片观察健康对照组和庆大霉素组耳蜗MOC传出神经和外毛细胞(outer hair cell,OHC)的分布特征,并测量耳蜗MOC传出神经纤维、末梢及OHC的数量。结果:停药后3周出现耳蜗MOC纤维和末梢损害,损害程度随观察时间延长而加重,11周最明显, 且损害部位主要在耳蜗底回,与毛细胞损害的特征一致。结论:耳蜗MOC传出神经可能在庆大霉素慢性耳中毒时OHC的损害中起重要作用。

  氨基糖甙类抗生素耳中毒的确切机制尚不明。近年来形态学和电生理研究证明,听觉感受与传入活动受内侧橄榄耳蜗(medial olivocochlear, MOC)传出神经系统的支配和调控[1,2],同时还发现氨基糖甙类抗生素急、慢性耳中毒时MOC功能明显损害[1-3],提示氨基糖甙类抗生素耳中毒可能与听觉传出神经系统损害有关。本研究采用乙酰胆碱酯酶组化染色法,观察庆大霉素慢性耳中毒后MOC传出神经纤维和末梢的形态改变,报道如下。

  材料及方法

  一、动物分组

  蒙古沙鼠36只,雌雄不限,体重50~60 g,外耳道及鼓膜正常。庆大霉素组24只,每天肌注庆大霉素150 mg/kg,连续10 d,分别于停药后3、7和11周处死,每个观察时间8只;健康对照组12只,与庆大霉素组同批处死,每个观察组4只。每只动物1耳行MOC传出神经染色,另1耳行毛细胞染色。

  二、MOC传出神经染色

  按以往采用的乙酰胆碱酯酶染色方法[4],动物注射1%戊巴比妥钠麻醉后,断头处死,迅速取出听泡,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer solution,PBS,pH7.4)洗去血液后,置于4℃固定液(4%多聚甲醛,0.5%戊二醛,0.2%苦味酸)中,立即去除镫骨,开放卵圆窗和圆窗,蜗尖钻孔,将固定液分别从蜗尖和两窗灌注,置4℃冰箱中继续固定过夜,经0.1 mol/L EDTA-Na2 (ethylene diamine tetraac-etic acid,乙二胺四乙酸)脱钙3 d,每天换液1次。然后去除蜗壳、螺旋韧带、盖膜,并分割成底回、第二回和蜗顶3段,室温下行组化染色。首先经0.1%H2O2 处理30 min,0.1 mol/L PBS 漂洗,后用1%Triton X-100处理1 h, 0.1 mol/L马来酸缓冲液(pH 6.0)漂洗,再置组化反应液(含35μmol/L碘代乙酰硫化胆碱、5μmol/L K3Fe(CN)6 、30μmol/L CuSO4、50μmol/L枸橼酸钠)中作用50 min,经50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)漂洗后置标记染色液(0.04%二氨基联苯胺和0.3%硫酸镍铵)中作用5 min,再置含0.003%H2O2的同一溶液中继续染色10~15 min, 最后在5 mmol/L Tris-HCl中漂洗,中止反应。标本染色后经梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

  三、毛细胞染色

  按Ulehlova等[5]的甲苯胺蓝-苏木素染色方法改良,过程如下:动物麻醉后断头处死,迅速取出听泡,用10%甲醛溶液从圆窗、卵圆窗灌注,后固定24 h,经0.1 mol/L EDTA-Na2脱钙,按上述方法制备标本后染色。先经0.1 mol/L PBS漂洗后, 在含1%乙醇的甲苯胺蓝饱和溶液中染色20 s, 0.1 mol/L PBS漂洗, 再经苏木素溶液中复染1min,0.1 mol/L PBS漂洗, 甘油封片。

  四、结果分析

  在网格测距器下计数并对比分析健康对照组和庆大霉素组第3、7和11周耳蜗底回、第二回和蜗顶MOC传出神经纤维、末梢及外毛细胞(outer hair cell,OHC)的数量,计算平均值,各组间差异行t检验

   结果

  一、MOC纤维和末梢在耳蜗的分布

  健康对照组MOC纤维及其末梢的密度和大小在耳蜗各回的分布不一致。在底回起始端纤维短,底回中部纤维细长,神经末梢小,其分布较稀疏(图1),底回远端和第二回神经纤维和末梢密而粗大,至蜗顶部相对稀疏而细小。庆大霉素停药后3周底回起始端和中部MOC纤维及末梢部分消失,第二回无明显变化;7周底回起始端和中部MOC纤维和末梢大部分消失(图2),跨隧道纤维减少,第二回纤维和末梢部分消失;11周底回起始端和中部MOC纤维和末梢基本完全消失,仅在远端残留少量MOC纤维, 第二回和蜗顶的纤维和末梢也明显减少,跨隧道纤维稀少。定量分析显示耳蜗MOC纤维和末梢损害依不同部位和观察时间而异,损害程度随观察时间延长而加重,以耳蜗底回和停药后11周损害最显著,差异有显著性(P<0.001,图3,4)。


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