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低密度脂蛋白胆固醇测定方法研究进展

来源:国外医学临床生物化学与检验学分册 作者:张式鸿 俞纯山 2004-9-27
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摘要: 摘要 血清或血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与冠心病(CDH)发生和动脉粥样硬化损伤呈正相关,而且是美国国家胆固醇教育计划(NCEP)作为脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。LDL-C也是选择药物治疗和预后方面的一个十分有意义的临床指标,国内外都在研究和开发行之有效、可靠的标准化测定方法。本文对其有关的测定......


   摘要 血清或血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与冠心病(CDH)发生和动脉粥样硬化损伤呈正相关,而且是美国国家胆固醇教育计划(NCEP)作为脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。LDL-C也是选择药物治疗和预后方面的一个十分有意义的临床指标,国内外都在研究和开发行之有效、可靠的标准化测定方法。本文对其有关的测定方法和研究进展作综述。

  关键词:低密度脂蛋白胆固醇;方法学;心血管疾病

  临床和流行病学研究证明血清中LDL-C与冠状动脉粥样硬化有密切的正相关[1]。在1986年病理学家们就研究证明LDL-C浓度越高时动脉粥样硬化损伤的程度越大,粥样硬化程度小时,测到血清中LDL-C也低[2,3]。

  lDL是一组不均一的脂蛋白颗粒,一般认为LDL的漂浮密度为1.006~1.063,且包括了中间密度脂蛋白(LDL)1.006~1.019及Lp(a)1.050~1.080。LDL中蛋白含量约为20%~25%,主要是载脂蛋白B-100(ApoB-100),而载脂蛋白E(ApoE)和载脂蛋白CⅡ(ApoCⅡ)含量很少。胆固醇的含量约是血清中总量的三分之二。LDL是通过受体途径进行降解,如过量时可以导致巨噬细胞和其他吞噬细胞变成泡沫细胞,这被认为是与动脉粥样硬化有关的因素。因此,LDL-C的测定结果直接影响到分类和治疗。美国的NCEP专家组以LDL-C浓度将成人、小孩、青少年各分为:成人在3.37mmol/L(1300mg/L)以下为合适水平,在3.37~4.12mmol/L(1300~1590mg/L)间作为中危水平,高于4.14mmol/L(1600mg/L)时作为高危水平;小孩和青少年在2.85mmol/L(1100mg/L)以下为合适水平,在2.85~3.34 mmol/L(1100~1290mg/L)为中危水平,高于3.37mmol/L(1300mg/L)为高危水平[4]。为提高LDL-C测检水平,国内外对LDL-C测定方法进行广泛的研究并不断改善,现将有关方法研究进展综述如下:

  1 等密度和密度梯度超速离心法

  血清中的各种脂蛋白的分离是LDL-C测定的一个重要环节。由于各种脂蛋白的大小、密度和组成及功能都有很大的不同。超速离心技术就是利用脂蛋白各种成分的密度不同将它们分离,是脂蛋白分离的主要方法。

  1950年Delalla和Gofman首次报道等密度超速离心法。在实验室中一般采用βQuantification(βQ)法,它利用1.006的临界分离液,在离心力为10900g时离心18h,将血浆分成上下两部分,上清液为VLDL和乳糜颗粒,下面为IDL、LDL和HDL。用试管切开技术将上下液体分开。下面部分再采用化学沉淀法将HDL和LDL及IDL分开,分别用酶法测定胆固醇。这方法已被临床实验室作为参考方法。而且还可以根据需要改变分离液密度,当密度提高为1.019,可以将IDL与LDL和HDL分开,也可提高到1.21,分离出HDL等。但在选择脂蛋白分离切点系指它们与缓冲液混和物的密度,而不是脂蛋白自身的密度。

  另外有报道用密度梯度超速离心法[5]。这种方法是将血清加入到已有不同密度梯度的分离液中,进行超速离心后,血清中脂蛋白的各种成份可以转移到各自相等密度的相等的区域。这种方法可以一次将脂蛋白中的各种成份分离。而不足之处是要求离心时间很严格,分开各种组份较困难。根据离心转子的不同,可以分为水平转子,垂直转子以及固定角度转子。水平转子在实验中已被证明分离效果最好,但要求离心时间长(17~66h);垂直转子可以缩短时间(45min~3h),由于转动距离小,会有微量丢失;在等密度超速离心中首选固定角度转子,如在密度梯度超速离心中使用时,离心时间要比垂直转子稍长。

  这两种方法对实验室要求条件高,一般实验室都难以应用。虽然现在有很多改良方法,克服了传统方法的部分缺点,但分离的效果仍不能同传统方法比。所有的超速离心法都有它们的局限性,它们所测得的结果仍是NCEP作为分类和治疗的指标。

  2谱法

  根据脂蛋白分子的大小和亲和性有很大的不同,利用层析技术对脂蛋白进行分离。目前有多种色谱仪和分离柱被用于脂蛋白的分离。而琼脂糖层析技术和Toya soda的高压凝胶层析技术使用最普遍。这种方法是非破坏性,可以回收各种成份,有报道[6]LDL-C的回收率可以达到80%~98%,但稳定性较差。目前这种技术也在不断完善,但要求实验条件高,操作繁琐,时间长,仪器昂贵,难以在临床实验室应用。

  3电泳

  电泳技术是基于脂蛋白分子所带的电荷和分子量大小不同进行分离,早期这种技术在临床实验室普遍用于定性分析,直接观察血清脂蛋白谱。现在已不再推广使用,大量实验证明电泳电量法所得的结果不能令人满意,并且发现与常规实验测得的结果有误差。有报道[7]肝硬化胆道阻塞病人的血清脂蛋白谱显示正常,而血清胆固醇浓度追忆忼于25.9mmol/L(10g/L)。因此还应进行总胆固醇(TC)测定。因为亲脂性染料不能和游离胆固醇以及磷脂结合。另外,可以与超速离心法和化学沉淀法联合使用,经分离后,进行某一组份纯度分析。免疫与电泳技术结合,可以大大提高准确度;以及全自动电泳分析仪出现,在常规实验室进行脂蛋白定量分析将成为可能。

  4 化学沉淀法

  4.1 肝素沉淀法 肝素在pH值5.12柠檬酸缓冲液中可以沉淀LDL,使LDL与其它脂蛋白分离,然后进行胆固醇测定。这种方法pH值很重要。pH值必须使LDL颗粒的脂蛋白所带电荷刚为正值。由于VLDL和LDL等电点分别为4.7和5.4,pH值5.12±0.02时LDL刚好可以完全沉淀,而VLDL不沉淀。肝素沉淀法与定量电泳法有很好的一致性,但当TG含量大于4.58mmol/L(4000mg/L)时,一致性相对降低。在Ⅲ型血浆脂蛋白增高症的病人血清中加沉淀剂时VLDL和Lp(a)与LDL发生共同沉淀,导致结果出现偏差。这种方法在TG低时,它有很好的精密度,变异系数小于3.5%。与等密度超速离心法比较,当TG浓度大于2.0mmol/L(1750mg/L)时,肝素法出现结果偏离[4]。近年Armstrong等[8]实验证明降低pH值到4.85时Lp(a)沉淀。

  4.2 聚乙烯硫酸(PVS)沉淀法 含有EDTA的PVS可将血清中LDL沉淀。PVS沉淀LDL是非离子相互作用,pH值影响较小,pH值在3~8范围内均可以沉淀。因此,并不需要精确的pH值。沉淀剂中EDTA与血清中二价离子结合,阻止VLDL共同沉淀,而聚乙二醇独甲醚(PEGME)加速LDL形成小球,可缩短沉淀时间。Assmann等[9]实验证明PVS法可以将LDL同HDL、VLDL和LpX分离,但Lp(a)则完全同LDL共同沉淀,实际结果应包括Lp(a)所含的胆固醇。当血清中TG浓度小于4.2mmol/L(3680mg/L)时,与超速离心法有很好的一致性,但当TG大于4.6mmol/L(4070mg/L)时,PVS法所得结果偏低,且随TG浓度的升高误差也随着增大。当血清TG低时,PVS法与其它所有方法都有很好的一致性,且有好的精确度,变异系数小于3.0%。

  4.3 多环表面活化法 本法采用pH值6.10的异吡唑缓冲液中非特异两歧性聚合物使LDL沉淀,然后将沉淀物重新溶解直接测定LDL-C或有TC与上清液胆固醇之差计算出。Moss等报道[10]此法与超速离心法和电泳法有很了的一致性,但与其他化学沉淀法一样受血清中的TG浓度影响


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