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胃癌中p16基因研究概况

来源:中国普外基础与临床杂志 作者:刘君 2004-9-24
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摘要: 分子生物学和基因工程技术的迅速发展使我们认识到,胃癌的发生同其他肿瘤一样是正常细胞内基因组多重改变的结果。自发的、化学物理性及病毒性致癌因素只是诱因,基因改变才是根本原因,它包括癌基因的激活和抑癌基因的失活〔1〕。p16(MTS1、CDKN2、CDK4I)基因是新近发现的抑癌基因,与p53基因相比,它具有突变率高、分子......


  分子生物学和基因工程技术的迅速发展使我们认识到,胃癌的发生同其他肿瘤一样是正常细胞内基因组多重改变的结果。自发的、化学物理性及病毒性致癌因素只是诱因,基因改变才是根本原因,它包括癌基因的激活和抑癌基因的失活〔1〕。p16(MTS1、CDKN2、CDK4I)基因是新近发现的抑癌基因,与p53基因相比,它具有突变率高、分子量小、易于标定等特点,因而很快成为肿瘤分子生物学研究的热点。本文就胃癌中p16基因的研究情况作一概述。

  1 p16基因的分子生物学特点

  1993年,Serrano等〔2〕在研究与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)相作用的蛋白时,用酵母双杂合蛋白相关性筛选(yeast two-hygrid protein interaction screen)法分离到了特异性CDK4抑制蛋白p16蛋白,并成功地克隆了其cDNA。1994年Kamb等〔3〕用STS-PCR(serveral-tagged sites-PCR,多标志位点PCR)方法研究了100个黑色素瘤细胞系,发现了在人第9号染色体短臂(9p21)区域存在有与Serrano等报道的p16序列相近的2个区域,分别命名为多发性肿瘤抑制因子1(multiple tumor suppressor 1, MTS 1)和多发性肿瘤抑制因子2(MTS 2),其中MTS 1与曾报道的p16基因完全吻合,而MTS2与p16基因有93%的序列同源,目前已命名为p15基因。与此同时,Nobori等〔4〕的研究也证实了上述结论。Serrano等〔2〕指出,p16基因定位于人第9号染色体的9p21区位,分布在全长为8.5 kb的DNA区段内,由3个外显子和其间的2个内含子组成,3个外显子的长度分别是126 bp、307 bp、11 bp。编码蛋白为15.845 kD、含有一个由148个氨基酸残基组成的开放阅读框架的单链多肽,具有4个沟回状重叠的空间构型,该结构特别是第4个重叠是保持p16基因的活性所必需的。

  2 p16基因在胃癌中的表达及意义

  国内外学者的研究结果表明,p16基因与胃癌分化、浸润、淋巴结转移及患者预后有显著的相关性,检测胃癌组织p16基因的各种变化,有助于对胃癌生物学行为的进一步了解和对患者预后的评估。

  p16基因在胃癌中可发生纯合性缺失、5’端CpG岛异常甲基化、表达下降等3种形式的改变。纯合性缺失是指两个等位基因完全丢失,表现为PCR扩增无产物或Southern杂交信号完全消失。事实上,在已普查过的近300个癌细胞株中,p16基因最易发生纯合性缺失,可能的原因是另有抑癌基因在9p21上与之连锁,如p15基因。CpG岛是DNA的一段区域,长度约0.5~2.0 kb,富含GC,在正常组织中没有甲基化〔5〕。p16基因常因转录启动区域5’-CpG岛异常甲基化而被灭活〔5,6〕,表现为等位基因不转录或异常转录,应用逆转录嵌套式聚合酶链反应(RT-NPCR)法可测得异常转录物。

  p16基因发现后不久,日本学者Igaki等〔7〕就对9例胃癌细胞株进行了Southern杂交分析,发现4例低分化胃癌细胞株中有2例(22%)发生纯合性缺失,而高分化组未见缺失。Akama等〔8〕用同法检查了8例胃癌细胞株,结果发现2例(25%)存在p16基因的纯合缺失,另有2例虽未测得基因改变,但均未表达p16,考虑存在5’-CpG岛异常甲基化。吕有勇等〔9〕检测5株胃癌细胞系,有1株(20%)存在p16基因纯合缺失,另有2例未见明显的基因丢失,但没有表达或表达下调;在85例胃癌组织中,14例(16.4%)存在p16基因纯合缺失,这些缺失的病例都属于低分化、有淋巴结转移的进展期胃癌,提示p16基因结构和表达异常与胃癌分化、转移相关。前不久,Chen等〔10〕运用RT-NPCR方法检测了10例肠型胃癌、11例弥漫型胃癌,结果分别发现3例(30%)和5例(45.5%)中存在异常p16 mRNA转录物,其中大多数有外显子1和外显子2的核苷酸序列的部分缺失,认为RT-NPCR法是检测小的基因内缺失的有效方法,异常p16 mRNA转录物在胃癌中属频发事件。另外,国内学者进行的大量胃癌中p16蛋白表达的研究充分显示,p16蛋白在胃癌组织中表达明显降低,且与胃癌分化、浸润、淋巴结转移、患者预后明显相关〔11,12〕。

  3 p16基因的生物学作用

  研究表明,细胞癌变与细胞周期失控密切相关,典型的一个细胞周期包括有顺序严格的4个期即G1→S→G2→M。细胞周期进行的关键在于CDKs的活化,而CDKs受细胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正负调节。已发现的8种cyclin中,尤以cyclin d家族对细胞增殖具有最重要的意义,实验表明,阻滞cyclin D的表达使细胞不能从G1期→S期,而其过表达则使G1期缩短〔13〕。cyclin d包括D1、D2、D3三个亚型,分别在不同的细胞系中表达。cyclin d1与CDK4/6结合形成复合物,能使视网膜母细胞瘤易感基因(即Rb基因,为一种抑癌基因)的蛋白产物PRb磷酸化,进而激活某些转录活化因子如E2F(异源双体转录子),E2F则能活化DNA合成基因和细胞生长控制基因,启动DNA合成,使细胞由G1期进入S期〔14〕。而p16蛋白则为CDK4/6抑制剂,对CDK4/6有高度亲和性,在细胞增殖的调控中,p16蛋白与cyclin d1竞争与CDK4/6结合,发挥负性调节作用,共同完成对细胞增殖周期的调控〔15〕。因此,当p16基因发生改变,在肿瘤组织中表达异常时,则有可能导致肿瘤发生、进展。

  4 p16基因与癌基因cyclin D1及抑癌基因Rb的关系

  cyclin D1对细胞增殖具有重要意义,其过度表达会导致细胞增殖失控,因而被认为是一种癌基因〔16〕。实验上,胃肠癌、乳癌、食管癌以及B细胞淋巴瘤中都有cyclin d1的过表达〔17〕。Rb基因则是经典的,也是最早发现的抑癌基因,cyclin d1、Rb基因对p16基因的调控具有重要的意义。

  Shapiro等〔18〕应用免疫组化和免疫印迹分析技术分别对PRb阳性占多数的非小细胞肺癌(NSCLC)和PRb阴性的小细胞肺癌(SCLC)的手术标本及细胞系进行了测定,结果显示PRb(+)的NSCLC几乎没有p16表达,而PRb(-)的SCLC则有高丰度的p16表达。Tam等〔19〕在体外转化细胞中的研究也得到相类似的结果,发现p16表达与Rb表达呈负相关。推测其可能机理是CDK在某些情况下被激活,如当p53失活或表达下调引起p21随之下调,激活了CDK,使Rb蛋白磷酸化而失活,Rb蛋白的抑制作用减弱,从而使p16蛋白表达代偿性增加,导致cyclin d1活性下降。p16的激活与cyclin D1的下调反过来抑制CDK的活性。因此,cyclin d1、Rb、p16和CDK共同组成了一个反馈调节圈。对细胞周期的研究发现,在生理情况下,在G1→S期的转化早期,cyclin d1水平增高,随G1→S期的转化,活化的cyclin D1/CDK4复合物渐趋失活,而此时p16表达达到高峰(失活的PRb通过转录因子E2F促进p16转录),p16反过来又抑制cyclin d1对CDK4/6的活化作用,当Rb基因突变或缺失或cyclin d1的过表达超出了p16基因的代偿能力时,细胞周期调节失控,细胞过度增殖导致癌变〔3〕。

  综上所述,由于p16基因与胃癌发生、进展有密切关联,其作用机理为直接抑制细胞周期,且p16基因分子量小,易于标定,用p16基因作靶分子进行基因操作或蛋白修饰,均比p53简单易行。因此,已有学者将外源性p16基因导入有p16基因表达异常的人胃癌细胞株中。结果显示,导入外源性p16基因对胃癌细胞系PAMC82的裸鼠致瘤性有十分明显的抑制作用〔20〕。另外,由于p16基因与Rb、cyclin d1等共同参与了细胞增殖周期的调节,因此,对p16基因的深入研究,对于阐明细胞周期演进的分子调节,乃至整个生命活动过程的调节,均具有重要的意义。

  作者单位:刘 君 蒲永东 解放军第309医院普外科(北京 100091)

  宋少柏 北京解放军总医院普外科

  参考文献

  1 Deng GR, Lu YY, Chen SM, et al. Actived c-H-ras oncogene with a guanine to thymine transversion at the twelfth codon in a human stomach cancer cell line. Cancer Res, 1987; 47(12)∶3159

  2 Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993;366(16)∶704


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