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生物芯片研究进展

来源:《生物工程进展》 作者:杨蓉 谢文章 张亮 2004-9-24
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摘要: 摘要生物芯片是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用生物芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应,从而达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学......


  通过杂交分析DNA的另一应用技术是重复测序。那么,重复测序是怎么工作的呢?首先,人们将长度为8-20个核苷的探针合成并固定到指甲盖大小的硅芯片或玻璃芯片上。当含有与探针序列互补的DNA被置于联有探针的芯片之后,固化探针就会通过与其序列互补的DNA片段杂交而结合[10]。通过使用带有计算机的荧光检测系统对“棋盘”每个格子上的荧光强弱及根据每个格子上已知探针的序列进行分析与组合就可得知样品DNA所含有的碱基序列。最近美国的Science杂志对应用芯片杂交技术测序作了报道。Chee等人在一块固化有135000个寡核苷酸探针(每个探针长度为25个核苷)的硅芯片上对长度为16.6kbp的整个人线粒体DNA作了序列重复测定。每个探针之间的空间间隔为35微米。测序精度为99%。另外Hacia还报道了一种微测序分析法(minisequencing-based assays)为检测所有可能的碱基序列变化提供了强有力的手段。此方法中需要将不同颜色荧光染料标记的四种ddNTP,加入到引物的酶促反应中,微阵列上固化的寡核苷酸用作酶促反应的引物,靶序列作为模板,可检测到靶序列上的碱基变化。用生物芯片从事杂交测序的美国公司有Affymetrix和Hyseq[29]。

  2.3.3 用作基因表达分析的DNA芯片

  随着人类基因组计划的顺序进行,越来越多的能够表达的人基因序列以及引发疾病和能预测疾病的各种突变正在为人们逐渐认识。为了能够同时对多个可能的遗传突变进行搜寻、加快功能基因组学研究的进程,人们现已把越来越多的注意力放到了能同时提供有关多个基因及其序列信息的所谓并行分子遗传学分析(parallel molecular genetic analysis)方法上。功能基因组学所研究的是在特定组织中、发育的不同阶段或者是疾病的不同时期基因的表达情况。因此它的要求是要能在同一时刻获得多个分子遗传学分析的结果。譬如,许多疾病引发基因可能会有数以百计的与表征有关的特定突变,因而,要求能有同时筛检这些突变的有效方法。另外,任何一个细胞中都会有上千个基因在表达。而细胞间基因表达的差异往往能反应出这些细胞是发育正常还是在朝恶性肿瘤细胞方向发展。采用芯片技术利用杂交对基因表达进行分析的好处是它能用很少的细胞物质便能提供有关多基因差异表达的信息,从而给疾病诊断和药物筛选提供前所未有的信息量[30]。Lockhart等人采用固化有65000个不同序列的长度为20个核苷的探针芯片,定量地分析了一个小鼠T细胞线中整个RNA群体内21个各不相同的信使RNA。这些专门设计的探针能与114个已知的小鼠基因杂交。分析发现在诱发生成细胞分裂后,另外有20个信使RNA的表达也发生了改变。检测结果表明该系统对RNA的检出率为1:300000,对信使RNA的定量基准为1:300[32]。Wang等人在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(etoposide)诱导的细胞程序性死亡时,利用DNA芯片技术,制备了一次可检测6591种人细胞信使RNA的寡聚核苷酸微阵列,检测到诱导后的细胞内有62种信使RNA的量发生了变化。通过挑选12个与诱导作用有关的基因作进一步研究,它们发现了2个新的p53靶基因[33]。DeRisi等人将一个恶性肿瘤细胞线中得到的870个不同的cDNA探针通过机械手“刷印”至载玻片上以观察癌基因的表达情况。在比较两个标有不同荧光标记的细胞信使RNA群的杂交结果之后,他们对引入正常人染色体后肿瘤基因受到抑制的细胞中的基因表达结果进行了分析[34]。另外,Shoemaker等人报道了一种利用生物芯片来确定许多新近发现的酶母基因的生物功能的所谓分子条形编码技术。这种技术的好处是它能让我们以并行的方式定量地分析很复杂的核酸混合物[35]。Lueking等人最近采用蛋白质微阵列技术,把作为探针的蛋白质高密度地固定在聚双氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride)上,并检测到了10pg的微量蛋白质测试样。对92个人cDNA克隆片段表达的产物进行检测,用单克隆技术作平行分析,证实了假阳性的的检出率低。由于蛋白质微阵列技术不受限于抗原-抗体系统,故能为高效筛选基因表达产物及研究受体-配体的相互作用提供一条新的有效途径[36]。

  2.4 缩微芯片实验室

  生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。1998年6月,Nanogen公司的程京博士和他的同事们首次报道了用芯片实验室所实现的从样品制备到反应结果显示的全部分析过程。他们用这个装置从混有大肠杆菌的血液中成功地分离出了细菌,在高压脉冲破胞之后用蛋白酶K孵化脱蛋白,制得纯化的DNA,最后用另一块电子增强的DNA杂交芯片分析证实提取物是大肠杆菌的DNA。这是向缩微实验室迈进的一个成功的突破[37]。目前,含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经研制出来了,而且,也出现了将样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片(例如,样品制备和PCR[38];竞争免疫测定和毛细管电泳分离[39])。相信不久的将来,包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现。


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