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鼠抗内毒素单链噬菌体抗体的制备

来源:中华微生物学和免疫学杂志 作者:陈鸣府伟灵俞丽丽张雪雷曼平 2004-9-24
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摘要: 内毒素(LPS)作为G-菌的毒性成分,在启动体内免疫系统反应、介导炎性介质因子的释放、导致脓毒症和中毒性休克中起着重要的作用。因此我们旨在制备出一株对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。首先用内毒素腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠共4周,从小鼠脾脏中提取总RNA,然后反转录合成cDNA第一链。利用RT-PCR技术扩增出小鼠抗体......


  近几十年来,G-菌的感染一直是困扰临床的一个主要难题。以前统计,美国每年有约40万的脓毒症患者,并发休克患者的死亡率高于50%。内毒素(LPS)作为G-菌的毒性成分,在启动体内免疫系统反应、介导炎性介质因子的释放、导致脓毒症和中毒性休克中起着重要的作用。因此我们旨在制备出一株对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。首先用内毒素腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠共4周,从小鼠脾脏中提取总RNA,然后反转录合成cDNA第一链。利用RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因(VH,VL),PCR扩增条件为:94℃ 1?min,55℃ 2?min,72℃ 2?min。循环30次。用Linker将等摩尔量的VH,VL交联形成单链抗体可变区片段(ScFv)。经NotⅠ、SfiⅠ双酶切后,在T4连接酶的作用下与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。然后在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经间接ELISA检测抗内毒素ScFv。

  实验结果表明:经RT-PCR扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,交联形成的ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,随机挑选190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。本研究所采用的PCR引物是根据小鼠抗体可变区FR1和FR4的保守碱基序列设计的,实验证明可以很好地扩出整套抗体可变区基因。而且,选用的SfiⅠ、NotⅠ限制性内切酶借助计算机分析在免疫球蛋白数据库中的抗体可变区基因序列中没有酶切位点。这就保证了本研究构建的单链噬菌体抗体库的有效表位多样性。本研究构建了一个库容量为1.9×107的单链噬菌体抗体库,并且通过先将转化细菌接种到SOBAG固相培养板这一步骤,避免了液相培养中克隆竞争的问题,减少了阳性克隆的丢失,并将库容量扩大至约1010。在经过仅仅一轮抗原筛选后,得到了3×104个克隆。最终随机挑选190个克隆,经过ELISA试验证实有2个阳性克隆,为进一步深入地研究该抗体及其人源化的工作奠定了基础。


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