乳腺癌细胞p16基因的研究

　　 摘　要　目的：探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。方法：采用细胞培养，反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞，经多聚酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析技术，对14例纯化乳腺癌细胞标本、14例新鲜未纯化标本和27例石蜡包埋标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因突变率进行了对比性研究。结果：纯化的乳腺癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14)，而新鲜未纯化细胞组、石蜡包埋细胞组及癌旁乳腺细胞组的p16基因突变率分别为7.1%、7.4%、4.9%，纯化乳腺癌细胞组的突变检出率显著高于其它3组，差异有显著性意义（P＜0.01)，其它3组突变检出率差异无显著意义（P＞0.05)。结论：在原发性乳腺癌中p16基因的纯合性缺失和小片段基因丢失可能是其失活的主要模式；纯化的癌细胞标本可大大提高p16基因的突变检出率。

　　我们采用细胞培养，反复贴壁法纯化人乳腺癌细胞，经多聚酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析技术对14例纯化乳腺癌细胞标本，14例新鲜未纯化乳腺癌标本，27例中性福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌标本及相应的癌旁乳腺组织标本的p16基因的3对外显子进行了检测。以探讨p16基因在乳腺癌中的突变形式和频率以及有效的检测手段。

　　资料与方法

　　1．标本：41例原发性乳腺癌标本为我院1997～1998年的手术，均为女性；年龄35～68岁。其中27例乳腺癌组织常规取材，经中性福尔马林固定12 h后，石蜡包埋，连续切片11张，1张行HE染色，10张经充分剔除周围非肿瘤组织后，留置作DNA抽提；14例术中取癌组织冰冻病理检查，对照HE染色，选取无坏死的肿瘤细胞集中部分取材，立即置入Hank′s液中，4℃冰箱暂存不超过24 h。所有病例均取癌旁乳腺组织标本置-20℃冰箱冻存。

　　2．实验材料与方法：12孔、24孔细胞培养板；CO2细胞培养恒温箱；倒置微生物显微镜；-20℃、-80 ℃低温冰箱；层流超净工作台；PCR仪；DYY-Ⅲ型稳压电泳仪；DYY-Ⅲ6型转移电泳仪；Hoefer mighty SmallⅡ电泳系统；紫外分光光度计。PCR引物由中科院上海植物生理所植物分子遗传实验室合成。引物序列参见文献［1，2］。

　　细胞培养、反复贴壁纯化癌细胞法按文献［3］方法。模板DNA的制备按文献［4，5］方法。所有DNA样本经紫外分光光度检测波长为260 nm及230 nm处的OD值，OD值均大于1.8。多聚酶链反应（PCR）按文献［2，5］方法。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳、鉴定。PCR产物的SSCP分析按文献［6］的方法。

　　3．统计学方法：用Fisher′s精确概率计算法（sas6.08），结果经t检验。

　　结　果

　　实验中建立了稳定的p16基因1～3外显子(exon)片断的PCR-SSCP检测体系。在27例石蜡包埋原发性乳腺癌标本中，1例p16基因exon1～3未见相应的扩增片段；1例exon 3未见扩增片段。14例新鲜未纯化癌标本中，1例未见exon1，1例未见exon 3相应的扩增片段。14例纯化癌细胞标本中，1例exon1～3均未见扩增片段，2例未见exon 1～2扩增片段，2例未见exon 3扩增片段。在全部扩增阳性癌标本中，仅有1例纯化癌细胞标本的p16基因第2 exon出现异常SSCP泳动条带。

　　纯化癌细胞组p16基因突变率为42.9%(6/14)，石蜡包埋癌细胞组、新鲜未纯化癌细胞组及癌旁乳腺组织细胞组分别为7.4%、7.1%、4.9%，纯化癌细胞组突变检出率显著高于其他3组，差异有显著性意义（P＜0.01），其他3组之间差异无显著意义（P＞0.05）。