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冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-16
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摘要: 冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程 本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌,经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。 1 菌种 1。1菌种来源 基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。2菌种特性 菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。...


冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程

  本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌,经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。

  1 菌种

  1.1菌种来源

  基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。

  1.2菌种特性

  菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。

  1.3制造用菌种库的建立

  从原始菌种库传出,经扩大后冻干保存,或由上一代制造用菌种库传出,扩大后冻干保存作为制造用菌种库,但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定,合格后方可投产。

  1.3.1划种LB琼脂平板

  应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长。

  1.3.2涂片革兰氏染色

  在光学显微镜下观察,应为典型的革兰氏阴性杆菌。

  1.3.3对抗生素的抗性

  应与原始菌株相符。

  1.3.4电镜检查

  应为典型大肠杆菌形态,并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

  1.3.5生化反应

  应符合大肠杆菌生物学性状。

  1.3.6干扰素的表达量

  在摇床培养,应符合原始菌种的表达量。

  1.3.7质粒检查

  应做该质粒的酶切图谱,并应与原始质粒相符。

  1.3.8表达的干扰素型别

  应用标准抗α干扰素血清做中和试验,证明型别正确。

  1.4生产菌种

  从制造用菌种库传出供生产用的菌种,称为生产菌种。

  1.4.1生产菌种的制备及检定

  取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2~3块,培养后挑取平板中5~10个菌落,分别培养后保存,然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定,至少重复一次,选出其中干扰素表达量最高的一份,供生产制备种子液用,其表达量应符合原始菌种的表达量。

  1.5种子液

  从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备:将1.4.1项检定合格的生产菌种,根据实际需要做扩充传代,作为罐培养的种子液。

  2 发酵培养

  2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。

  2.2发酵培养基

  应为适于发酵培养的培养基,根据菌种的抗生素抗性,培养若中允许加入少量抗生素,但应尽量避免含有β椖邗0防嗫股亍?/P>

  2.3发酵培养参数

  根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。

  3 收集菌体

  用离心法或其他适宜方法收集菌体,菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。

  4 菌体裂解

  用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。

  5 制备粗制干扰素

  菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。

  6 纯化

  粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。

  7 加白蛋白

  取干扰素半成品原液检定合格后,立即另入适量人白蛋白保护剂,即为“加人白蛋白半成品”,保存于?/FONT>30℃。

  8 稀释、除菌过滤

  将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度,补加人白蛋白,使最终含量1%~2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌,除菌后抽样进行干扰素效价测定,热原质试验和无菌试验,合格后进行分装冻干。

  9 分装、冻干

  9.1 每支安瓿分装1ml,内含α2a干扰素100或300万IU。

  9.2 冻干过程制品温度不得超过33℃。

  9.3 冻干后成品置10℃以下干燥处保存,成品检定合格后进行包装。

  10 半成品检定

  每批半成品抽样进行10.1~10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9~10.12项检定。

  10.1 效价测定

  用细胞病变抑制法,Wish细胞/VSV为基本检测系统,用国家参考品校准为IU。

  10.2 蛋白含量

  用Lowry法测定。

  10.3 比活性

  应≥108Iumg蛋白。

  10.4 纯度

  10.4.1 电泳纯度

  用非还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,经扫描仪扫描纯度应在95%以上,聚合体不得超过10%。

  10.4.2 高效液相色谱纯度

  用280nm检测,应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。

  10.5 分子量

  用还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,α2a干扰素分子量应为19KD±10%。

  10.6 残余外源性DNA含量

  用同位素或生物素标记探针法测定,每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。

  10.7 残余鼠IgG含量

  用酶标或其他敏感方法测定,每剂量(20μg)的鼠IgG含量应在100ng以下。

  10.8 残余工程菌蛋白含量

  用酶标或其他敏感方法测定,残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。

  10.9 残留抗生素活性

  半成品中不应有残余抗生素活性存在。

  10.10 肽图测定

  应符合α2a型干扰素图形,批与批之间图形应一致。

  10.11 等电聚集

  测定等电点,α2a型干扰素等电点应5.7~6.7范围内。

  10.12 紫外光谱扫描

  检查半成品的吸收光谱,批与批之间应一致,α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。

  11 除菌半成品检定

  11.1 效价测定

  同10.1项。

  11.2 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  11.3 热原质试验

  按《生物制品热原质试验规程》进行,注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg,判定标准按该规程4.1项要求进行。

  12 成品检定

  12.1 外观

  应为白色或微黄色疏松体,另入1ml灭菌注射用水溶解后,不得含有肉眼可见的不溶物。

  12.2 pH值

  pH值应为6.5~7.5。

  12.3 效价测定

  同10.1项。其效价应为标示量的80%~150%。

  12.4 水分含量

  应≤3%(g/g)。

  12.5 鉴别试验

  用中和试验法,其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。

  12.6 HBsAg检测

  用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定,应为阴性。

  12.7 无菌试验

  同11.2项,每批抽样不少于10支。

  12.8 热原质试验

  同11.3项。

  安全试验

  12.9.1 豚鼠试验

  用体重300~400g豚鼠2只,每只腹侧皮下注射干扰素1ml,观察7天,局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。

  12.9.2 小白鼠试验

  用体重18~20g小白鼠5只,每只腹腔注射干扰素0.5ml,观察7天,动物全部存活,每只体重增加判为合格。

  13 保存与效期

  保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。

冻干基因工程α2a干扰素使用说明书

  本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠肝菌,经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。本品为白色疏松,每支含α2a型干扰素100万或300万IU,具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能等生物学活性。用于治疗某些病毒性疾病,如两型肝炎、慢性活动性乙型肝炎、带状疱疹和尖锐湿疣等。对于毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、表面膀胱癌和肾癌等均有良好疗效。

  用法

  每支用灭菌注射用水1ml溶解,通常根据病种确定给药方法、剂量、间隔和疗程。常采用皮下或肌内注射,尖锐湿疣亦可采用病损基底部注射。成人常用剂量每天1~3×106IU,肿瘤患者可适当加大剂量。连日或隔日注射,疗程遵医嘱。

  注意事项

  1.使用本品后少数病人可发热或伴有寒战、头痛、乏力、肌痛、关节痛等流感样症状,常出现在用药的第一周,可在注射后48小时内消失。如遇有严重不良反应,须修改治疗方案或停止用药。

  2.过敏者不可使用,严重心脏病患者、肾功能不良者、中枢神经系统功能紊乱者不宜使用。孕妇及小儿慎用。

  3.一旦发一过敏反应,应立即停止用药,并给予适当的治疗。

  4.本品溶解后为无色透明液体,如遇有混浊、沉淀现象,则不宜使用。

  5.用注射用水溶解时应沿瓶壁注入,以免产生气泡,溶解后须于当日用完,不得放置保存,以免生物活性下降或污染。

  保存

  保存于10℃以下干燥处。


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