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冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-16
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摘要: 冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程 本品系用特定的诱生剂诱导健康人白细胞,经提取后制成的冻干干扰素注射剂。1白细胞 献血员供血应符合献血员体检及化验标准。 白细胞的分离,应在采血后48小时内进行。活细胞数应达到90%以上。...


冻干精制人白细胞干扰素制造及检定规程

  本品系用特定的诱生剂诱导健康人白细胞,经提取后制成的冻干干扰素注射剂。用于某些病毒性疾病和肿瘤的辅助治疗,对免疫缺陷性疾病也有一定疗效。

  1 制造

  1.1制造要求

  1.1.1白细胞

  献血员供血应符合献血员体检及化验标准。一次供血不超过400ml,供全血间隔在3个月以上。

  白细胞的分离,应在采血后48小时内进行。活细胞数应达到90%以上。

  1.1.2诱生病毒

  采用新城疫病毒(NDV)F株或仙台病毒,经检定血凝效价达到适宜滴度,方可投产。

  1.1.3培养液

  采用RPMI-1640,内含适量人血清和庆大霉素或卡那霉素。不得使用β椖邗0防嗫股亍R部捎闷渌室伺嘌骸?/P>

  1.1.4制造工作室的设置,应符合工艺流程要求。冷库及各种生产用具,必须专用,严禁与其他异种蛋白质混用。制造工作室建筑应便于清洁、消毒、防霉。在制造过程中,应采取各种有效措施,防止细菌及热原质污染。直接接触制品的用具,用后应立即洗净,用前应除热原质及灭菌处理。

  1.1.5生产用水应符合饮用水标准,直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定,未纳入试行标准者应不低于分析纯。

  1.2制造工艺

  1.2.1诱生病毒

  采用9~10日龄健康鸡胚,于尿囊腔接种适量病毒,37℃培养48~72小时,鸡胚发育良好,病毒达到适宜滴度后,收集尿囊液,并做无菌试验,合格后合并,抽样做滴度测定,放?/FONT>20℃待用。亦可用其他适宜方法制备诱生病毒。

  1.2.2 白细胞悬液

  用离心法分离血浆,吸取白细胞层,用氯化铵液裂解红细胞,或用其他适宜方法分离白细胞。然后用培养液稀释,以每ml含活细胞1.0×107为宜。

  1.2.3 起动与诱生

  白细胞悬液中加入少许白细胞干扰素,于37℃水浴搅拌培育2小时,加入适量诱生病毒,待干扰素效价达到最高峰时,收集上清,即为粗制干扰素,置?/FONT>20℃保存。

  1.2.4 纯化

  在粗制干扰素(效价应在1.0×104IU以上)中加入硫氰酸钾盐析,然后分别在酸性和碱性条件下用乙醇分级沉淀,去除杂蛋白,再用硫氰酸钾提纯一次。亦可采用经卫生部批准的其他适宜方法。

  1.2.5 溶解、透析或超滤

  检查硫氰酸钾为阴性,除菌过滤后进行半成品检定。合格后方可分装、冻干。

  1.2.6 半成品检定

  半成品应做理化检查和比活性测定,比活性应≥1.0×106IU/mg蛋白。加入人血白蛋白作保护剂后,应做无菌试验、安全试验和热原质试验。试验方法及判定标准同成品检定。

  1.2.7 冻干

  按《人血白蛋白(低温乙醇法)制造及检定规程》1.2.5项规定进行冻干,但制品温度不得超过35℃。

  2 成品检定

  2.1 外观

  本品应为白色或淡黄色疏松体,加水溶解后,为无色或淡黄色澄清液体,不得有摇不散的颗粒。

  2.2 化学检定

  按《生物制品化学检定规程》进行。

  2.2.1 水分测定

  水分含量应≤3%(g/g)。

  2.2.2 pH值

  pH值应为6.8~7.8。

  2.2.3 硫氰酸钾残余量测定。

  取2滴干扰素原液加2滴9%三氯化铁溶液,不呈现微红色为合格。

  2.3 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。每批抽样品不少于10支。

  2.4 热原质试验

  按《生物制品热 原质试验规程》进行。每只家兔静脉注射0.2ml(2×105IU)。判定标准按该规程4.1项要求进行。

  2.5 全试验

  2.5.1 豚鼠试验

  用体重300~400g豚鼠2只,每只腹侧皮下注射干扰素1ml(1.0×106IU),观察7天,动特健存,每只体重增加者为合格。如不符合上述要求,用4只豚鼠复试一次,判定标准同前。

  2.5.2 小白鼠试验

  用体重18~20g小白鼠5只,每只腹腔注射干扰素0.5ml(5×105IU),半小时内动物不应有明显的异常反应,继续观察7天,动物均健存,每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求,用10只小白鼠复试一次,判定标准同前。

  2.6 HBsAg检测

  每安瓿冻干制品(1ml装)加0.1ml灭菌注射用水溶解,用敏感性为1ng/ml以下的试剂盒测定,应为阴性。

  2.7 效价测定

  按附录方法测定,应为标示量的80%~150%。

  2.8 残余牛血清蛋白含量测定

  如采用组织培养法制备诱生病毒,则成品中残余牛血清蛋白含量应≤50ng/支。

  3 规格

  1.0×106IU/支

  4 保存与效期

  应保存于10℃以下。有效期自品效价检定合格之日起为1.5年。

  附录干扰素效价测定

  采用CPE(细胞致病效应)抑制为基础的抑制微量测定法,以每ml干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50)免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位。以国际单位(IU)表示,并用国家标准品校正结果。

  1 细胞培养

  将新鲜传代24~48小时的Wish细胞(人羊膜细胞)以约35万/ml的浓度另入96孔组织培养板上,每孔100μl,置37℃5%CO2孵箱中培养4~6小时。

  2 样品稀释与细胞混合

  干扰素检品做4倍系列稀释,每份检品做6个稀释度(如100万单位,则测4-12~4-7)每个稀释度加2孔,与培养板中的细胞等量混合,置37℃5%CO25%CO2孵箱培养18~24小时。

  3 加病毒

  倒掉培养板中的上清液,以100CCID50/ml的浓度加入VSV(水泡性口腔炎病毒),每孔100μl,37℃5%CO2孵箱培养24小时左右。

  4 观察结果

  显微镜下观察细胞病变,若病毒对照各孔细胞出现75%~1000%的明显病变和死亡(变圆、死亡、脱落(,而细胞对照组中的细胞仍生长良好(病变=0),则表明对照系统合格,结果成立。

  5 计算

  通常可按Reed?/FONT>Muench法计算,其步骤如下:

  (1)计算保护百分比

稀释度 病变平均值

(每孔)

正常平均值

(每孔)

累积数 比例 百分比

  (%)

病变 正常 正常/病变+正常
4-1 0 4 0 13 13/13 100
4-2 0 3 0 9 9/9 100
4-3 1 2 1 5 5/6 83

4-4

2

2

3

2

2/5

40

4-5

4

0

7

0

4-6

4

0

11

0

  (2)求出干扰素单位

  距离比=(·高于50%的百分数-50)/(高于50%的百分数-低分50%百分数)=(83-50)/(83-40)=33/43=0.77

  即此批干扰素稀释到4-3。77(1∶186)时能保护半数细胞免受攻击病毒损害。此批干扰素效价为186单位,经国家标准品修正,得出干扰素的国际单位(以IU表示)。

冻干精制人白细胞干扰素使用说明书

  本品系用特定诱生剂,诱导健康人白细胞,经提取后制成的冻干干扰素注射剂,为白色或淡黄色疏松体,加水溶解后为无色或淡黄色澄清液体。用于某些病毒性疾病和肿瘤的辅助治疗,对某些免疫缺陷性疾病也有一定疗效。

  主要用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、流行性出血热、尖锐湿疣、毛细胞白血病、小儿婴幼儿病毒性肺炎、子宫颈炎、疱疹性角膜炎、带状疱疹、流行性腮腺炎等疾病。如与化疗、放疗配合治疗肿瘤,可改善患者血象和全身症状。

  用法 

  本品用1~2ml灭菌注射用水溶解。可肌内注射或病变局部使用。肌内注射,每日1~2次,每次一支,连续5~10天为一疗程,每疗程间隔2~3天,或遵医嘱。

  注意事项

  1.对鸡蛋过敏者忌用。

  2.注射本品后,一般无反应,个别患者注射后有低热反应或不同程度不适,停药后即可消失。

  3.如安瓿有裂纹或溶解后有摇不散的颗粒,不可使用。

  保存

  应保存于10℃以下暗处。


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