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冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-16
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摘要: 冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程 本品系用从健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因重组质粒,转染大肠杆菌,使之高效表达人α1b干扰素,经高度纯化后冻干制成。 1 菌种 1。1菌种来源 系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。2菌种特性 菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。...


冻干基因工程α1b干扰素制造及检定规程

  本品系用从健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因重组质粒,转染大肠杆菌,使之高效表达人α1b干扰素,经高度纯化后冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。

  1 菌种

  1.1菌种来源

  系带有人α1b干扰素基因的pBVXα1b质粒转化的大肠杆菌JM103株。投产的工程菌需经卫生部批准。

  1.2菌种特性

  菌种表达稳定,表达水平符合投产菌种要求。

  1.3制造用菌种库的建立

  从原始菌种库传出,经扩大后冻干保存,或由上一代制造用菌种库传出,扩大后冻干保存作为制造用菌种库,但每次只限传三代。每批制造用菌种库均应进行下列检定,合格后方可投产。

  1.3.1划种LB琼脂平板

  应呈典型大肠杆菌集落形态,无其他杂菌生长。

  1.3.2涂片革兰氏染色

  在光学显微镜下观察应为典型的革兰氏阴性杆菌。

  1.3.3对抗生素的抗性

  应与原始菌种相符。

  1.3.4电镜检查

  应为典型大肠杆菌形态,排除支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

  1.3.5生化反应

  应符合大肠杆菌生物学性状。

  1.3.6干扰素表达量

  在摇床中培养,应符合原始菌种的表达量。

  1.3.7表达的干扰素型别

  应用标准抗α型干扰素血清作中和试验,证明型别无误。

  1.3.8质粒检查

  应做该质粒的酶切图谱,应与原始质粒相符。

  1.4种子液制备

  1.4.1菌种传代用LB培养基

  液体LB培养基不含琼脂,供摇床培养用,含2%琼脂供制备平板和斜面用,含0.5%琼脂的半固体供短期保存菌种用。

  1.4.2生产菌种的制备和检定

  取制造用菌种库冻干菌种,开启后划种培养基平板2~3块,培养后挑取平板中典型集落8~10个,分别培养后保存,然后分别进行干扰素表达量测定,至少重复一次,先其中干扰素表达量最高的一份供生产制备种子液用,其表达量应符合原始菌种库的表达量,所表达的干扰素应用标准抗α型干扰素血清作中和试验,证明型别无误。

  1.4.3种子液的制备

  将菌种接种M9CA培养基,在摇床中培养至OD值在0.4~0.8之间即可供发酵罐接种用。种子液应进行质粒稳定性检查。

  2 发酵

  2.1每次发酵前必须进行一次空罐灭菌。

  2.2发酵用GMD培养基,用蒸馏水配制,其中不含有任何抗生素,配制后进行实罐灭菌。

  2.3发酵温度为36.5±0.1℃,根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度,并作必要的培养基成分添加,发酵时间根据工程菌生长情况确定。发酵结束时放出菌液,发酵灌应再进行一次灭菌并清洗。

  3 收菌

  用离心法收取菌体,称重,容器上标明批号、罐别、重量、日期。收获的菌体如在24小时内破菌裂解可保存于4~8℃冷库,否则应置?/FONT>30℃冻存。

  4 菌体裂解与粗制干扰素制备

  用高压匀浆法裂解菌体,将菌体作成10%~20%的悬液进行高压匀浆,压力50Mpa/cm2,连续匀浆二次,匀浆后的悬液离心后取上清即为粗制干扰素。

  5 浓缩与纯化

  5.1初步纯化

  采用不同原理多步骤的方法,使初步纯化的干扰素达到外观无色透明,无絮状物,比活性在105IU/mg蛋白以上,并将其浓缩至原体积的1/10~1/20,保存于4℃,如3天内不能进行高度纯化,应冻存于?/FONT>30℃冰箱内。

  5.2高度纯化

  经初步纯化后进行高度纯化,去除绝大部分非干扰素蛋白,使其达到本规程7~8项要求。高度纯化应在洁净度为10000级的恒温(15~18℃)室内进行。

  5.3在高度纯化过程中应进一步浓缩,使体积为初步纯化干扰素的1/5~1/10。并应转换缓冲液系统,使之适合于人体注射用。

  5.4在整个浓缩与纯化过程中不得加入对人体有害的物质。

  5.5在浓缩纯化过程中应特别注意去除热原质,用于分子筛层析的溶液,配合后应进行去除热原质处理。容器应干热灭菌,不能干热灭菌者应用适当浓度的NaOH处理。

  5.6浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”,取样进行7.1~7.4项检定后,立即加入人白蛋白,使其最终含量为2%,称为“加白蛋白半成品”,取样测定干扰素效价,其余冻存于-30℃冰箱中,应尽量避免冻融。

  5.7所用的人白蛋白应符合相应规程要求,HBsAg。

  6 稀释、除菌过滤

  6.1将检定合格的加白蛋白半成品以乳径为0.22μm的滤膜除菌过滤,除菌后立即进行稀释。

  6.2稀释液制备

  用合格的蒸馏配制生理盐水,经高压灭菌,加入检定合格的注射用人白蛋白,使最终含量为2%,即为稀释液。配制后应立即用于稀释。

  6.3稀释

  除菌后加白蛋白半成品用稀释液稀释至所需浓度。稀释后用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌,保存于4℃,并取样作无菌试验和热原试验,合格后进行冻干。

  7 半成品检定

  每批半成品抽样进行7.1~7.7项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行7.8~7.12项检定。

  7.1效价测定

  用细胞病变抑制法,Wish细胞/VSV为检测系统。用国家参考品校准为IU。

  7.2蛋白含量

  用Lowry法测定。同批不同阶段的样品比较时应尽可能同时测定。

  7.3比活性

  根据效价测定及蛋白含量计算比活性,本品的比活性应在107IU/mg蛋白以上。

  7.4纯度

  7.4.1电泳纯度

  用非还原型SDS?/FONT>PAGE法,加样量不低于5μg,经扫描仪扫描,纯度应在95%以上,聚合体不得超过10%。

  7.4.2高效液相色谱纯度

  用280nm检测,应呈一个吸收峰,或主峰占总面积95%以上。

  7.5分子量测定

  用还原型SDS?/FONT>PAGE法。加样量不低于5μg。制品的分子量与理论值比较,误差不超过10%。

  7.6残余外源性DNA含量

  用固相斑点杂效法,以地高辛标记的核酸探针法测定,其含量应少于100pg/剂量。

  7.7残余IgG含量

  如采用单克隆抗体亲和层析法纯化,应进行本项检定。采用ELISA双抗体夹心法测定,IgG含量应少于100ng/剂量。

  7.8残余工程菌蛋白含量

  用酶标法或其他敏感方法测定,残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%.

  7.9抗生素活性

  半成品中不应有残余氨苄青霉素活性。

  7.10肽图测定

  应符合α1干扰素的图形,批与批之间图形应一致。

  7.11等电聚集

  测定等电点,应有固定的范围(4.0~6.5之间)。

  7.12紫外光谱扫描

  检查半成品的光谱吸收值,批与批之间应一致,应有固定的最大吸收值。

  8 除菌半成品检定

  8.1效价测定

  同7.1项。

  8.2无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  8.3热原质试验

  按《生物制品热原质试验规程》进行。每只家兔静脉注射干扰素5万,判定标准按该规程4.1项要求进行。

  9 成品检定

  9.1处观

  应为微黄色薄壳状疏松体,加入1ml蒸馏水后溶解迅速,不得含有肉眼可见的不溶物。

  9.2 pH值

  pH值应为6.5~7.5。

  9.3无菌试验

  同8.2项。每批抽样不少于10支。

  9.4水分

  应≤3%。

  9.5热原质试验

  同8.3项。

  9.6价测定

  同7.1项。效价应为标示量的80%~150%。

  9.7安全试验

  9.7.1豚鼠试验

  用体重300~400g豚鼠2只,每只腹侧皮下注射1ml(于1ml生理盐水内),观察7天,豚鼠应健存,每只体重增加判为合格。

  9.7.2小白鼠试验

  用体重18~20g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5ml(于0.5ml生理盐水内),观察7天,动物应健存,每只体重增加判为合格。

  10规格

  10μg/瓶,20μg/瓶和30μg/瓶。

  11保存与效期

  保存于2~8℃,自效价检定合格之日起效期为2年6个月。

冻干基因工程α1b干扰素使用说明书

  本品系用健康人白细胞中获得的α1b干扰素基因组建杂交质粒,转化大肠杆菌,使之高效表达人α1b干扰素,经高度纯化后冻干制成。本品为微黄色疏松体,每支含α1b干扰素10μg、20μg或30μg,相当于用MDBK/EMC系统测定的效价100万单位,200万单位和300万单位,用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎及毛细胞白血病的治疗。

  用法

  每支用灭菌注射用水1ml溶解,肌内或皮下注射,不得静脉注射,建议晚上给药。剂量及疗程推荐如下:

  毛细胞白血病:40~60μg,每天注射一次,连续用药6个月以上。可根据病情适当调整,缓解后可改为隔天注射1次。

  慢性乙型肝炎:40μg(20~60μg),每天注射一次,或在用药4周后改为每周3次,连续治疗3个月或更长。

  副反应

  最常见的副反应为发热和疲劳,常在开始用药阶段出现,多数为低热(38℃以下),一般为一过性。其他副反应有头痛、肌痛、关节痛、食欲不振、恶心等。

  常见的化验异常是颗粒白细胞减少和血小板减少,停药后可恢复。

  如出现上述患者不能忍受的严重副反应,应减少剂量或停药,并进行对症治疗。

  禁忌证

  1.已知对干扰素制品过敏者;

  2.有心绞痛、心肌梗塞病史以及其他严重心血管病史者;

  3.有其他严重疾病,不能耐受本品之副反应者;

  4.癫痫和其他中枢神经系统功能紊乱者。

  注意事项

  1.凡有明显过敏体质,特别是对抗生素有过敏者,本品应慎用, 必须使用时应先用本品作皮肤试验(1:100稀释,皮内注射),阴性者方可使用。在使用过程中如发生过敏反应应立即停药,并给予相应治疗。

  2.使用前应仔细检查安瓿,如安瓿有裂缝、破损不可使用。在加入灭菌注射用水后稍加振荡,制品应溶解良好,如有不能溶解的块状或絮状物,不可使用。

  3.制品溶解后应一次用完,不得分次使用。

  保存

  保存于2~8℃暗处。


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