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吸附精制白喉类毒素制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-16
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摘要: 吸附精制白喉类毒素制造及检定规程 本品系精制白喉类毒素经氢氧化铝吸附制成。 1 毒素制造 1。3 毒素 1。1 毒素制造过程应严格控制杂菌污染。...


吸附精制白喉类毒素制造及检定规程

  本品系精制白喉类毒素经氢氧化铝吸附制成。用于预防白喉。

  1 毒素制造

  1.1菌种

  1.1.1 应选用中国药品生物制品检定所分发或同意的白喉杆菌PW8株,或经由PW8株筛选的产毒高、免疫力强的菌种。必要时可对菌种进行筛选。

  1.1.2 菌种宜用冻干法保存。亦可用血清斜面或产毒培养基传代保存,但代数不宜过多。

  1.2 培养基

  宜用胰酶牛肉消化液培养基或其他适宜培养基,但不得采用马肉或其他马体组织,应尽量减少对人体引起过敏反应的物质,不应含有可以引起人体毒性反应的物质。

  1.3 毒素

  1.3.1 毒素制造过程应严格控制杂菌污染。凡经镜检或纯菌试验发现污染者应废弃。

  1.3.2 用于生产的毒素效价不得低于150Lf/ml。

  1.3.3培养物加甲醛溶液或甲苯杀菌后进行精制或过滤后进行脱毒。所用化学原料应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》。

  2 精制

  2.1毒素或类毒素可采用硫酸铵活性炭二段盐析法或其他适宜方法精制。

  2.2用于精制的毒素或类毒素可多批混合,但不得超过5批。

  2.3精制过程应避免染菌,透析过程可加适量防腐剂,有肉眼可见染菌者应废弃。

  2.4 化学原料等级应不低于化学纯。

  2.5用同一菌种、培养基处方、精制方法制造的类毒素在同一容器内混合均匀后除菌过滤者为1批。除菌不彻底者可重滤。

  3 类毒素制造

  3.1制造过程应减少污染机会,如有肉眼可见染菌应予废弃。

  3.2 毒素或精制毒素中加入适量的甲醛溶液,置适宜温度进行脱毒。精制毒素亦可加适量赖氨酸后再加甲醛脱毒。所用化学原科等级不应低于化学纯。

  3.3 脱毒试验

  每瓶类毒素或精制类毒素取样,用灭菌生理盐水分别稀释至100Lf/ml,用体重2.0kg左右的家兔2只,每只动物分别皮内注射上述稀释样品各0.1ml及25倍稀释的锡克毒素0.1ml,于96小时判定结果。样品注射部位须无反应或仅有几无可量的反应,锡克反应须为阳性。

  3.4 脱毒不完全者可继续脱毒,必要时可补加适量甲醛溶液。

  3.5 用于生产的类毒素效价不应低于100Lf/ml。

  3.6 毒性逆转试验

  每瓶精制类毒素取样,用pH7.0~7.4磷酸盐缓冲盐水分别稀释至30~50Lf/ml,置37℃20~30天,用体重2.0kg左右的家兔2只,每只家兔分别皮内注射上述稀释样品各0.1ml及25倍稀释的锡克毒素0.1ml,于72小时判定结果。样品注射部位红肿反应直径不应超过15mm,锡克反应须为阳性。

  3.7 精制类毒素应加0.01%(g/ml)硫柳汞为防腐剂,毒素精制法制造的精制类毒素未除游离甲醛者可免加防腐剂。

  3.8 类毒素保存于2~8℃,自脱毒合格之日起不得超过3年。

  4 精制类毒素检定和保存

  4.1pH应为6.4~7.4

  4.2 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行

  4.3 纯度

  应不低于1500Lf/mgPN。

  4.4 安全试验

  用生理盐水将各亚批等量混合的精制类毒素稀释成50Lf/ml,用体重300~400g豚鼠4只,每只腹侧皮下注射5ml,观察30天。前5日注意观察注射局部,第10、20、30天称取体重。观察期间每只动物体重不得持续下降,到期每只动物体重应比注射前增加,注射局部无坏死,无连片脱皮、脱毛。后期不得有麻痹症状。

  4.5 效力试验

  将各亚批等量混合的精制类毒素稀释成35Lf/ml,用体重270~350g健康豚鼠5只,每只皮下注射0.5ml,第30天各攻击10MLD白喉毒素。用于配制含有百日咳菌苗的制品,可按成品比例与百日咳菌苗配成小量二联制剂样品,免疫方法与剂量同上,第30天各皮下攻击50MLD白喉毒素。二种攻毒均观察7日,攻击后动物死亡数不得超过20%。同时另用体重240~270g健康豚鼠3只,各皮下攻击1MLD白喉毒素作对照,其中2只应在96小时内死亡,允许1只晚死或发病。

  4.6 保存与效期

  保存于2~8℃。自精制之日起效期为3年半。

  5 吸附剂的配制

  见《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中5项。

  6 吸附精制类毒素的制造

  6.1吸附制品应含精制白喉类毒素30~50Lf/ml。

  6.2氢氧化铝用量不得超过3mg/ml。

  6.3 吸附制品应加0.005%~0.01%(g/ml)硫柳汞为防腐剂。

  6.4 同批精制类毒素及同批吸附剂吸附的制品为1批。用大罐吸附者每罐为1批,所用精制类毒素及吸附剂可多批混合,但各不得超过3批。

  7 成品检定

  7.1理化性状

  7.1.1 吸附精制白喉类毒素振荡后应为乳白色均匀悬液,无摇不散的凝块或异物。

  7.1.2pH值应为6.0~7.0。

  7.1.3 氢氧化铝含量不应超过3mg/ml。

  7.1.4 氯化钠含量为0.75%~0.9%(g/ml)。

  7.1.5硫柳汞含量不应超过0.01%(g/ml)。

  7.1.6 游离甲醛含量不应超过0.02%(g/ml)。

  7.2 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  7.3 安全试验

  每亚批取样等量混合,用体重300~400g健康豚鼠4只,每只腹侧皮下注射2.5ml,观察30天,注射部位可有浸润,经5~10天变成硬结,30天可吸收不完全,在第10、20、30天称体重,到期每只动物体重比注射前增加,豚鼠无晚期麻痹者评为合格。

  7.4 效力试验

  每亚批取样等量混合,用体重300~350g健康豚鼠5只,每只皮下注射0.1ml,第30天各皮下攻击200MLD白喉毒素,观察7日,攻毒后动物死亡数不应超过20%。同时另用体重240~270g健康豚鼠3只,各皮下攻击1MLD白喉毒素作对照,其中2只应在96小时内死亡,允许1只晚死或发病。

  亦可按WHO推荐的效力试验方法(见附录)进行。

  7.5 稳定性试验

  生产工艺有改变时应做稳定性试验。抽三批不同批号的精制类毒素配制的成品,保存于2~8℃,在效期结束之日进行效力检定,应符合规程要求。

  7.6 鉴别试验

  抽取样品加构橼酸钠将吸附剂溶解后作絮状试验,或将样品调pH至9.0作凝胶免疫沉淀试验,以出现絮状反应或免疫沉淀反应者为合格。

  8 保存与效期

  保存于2~8℃。自吸附之日起效期为3年。

  附录WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法

  可选用以下两种方法之一种进行。

(一)Vero细胞测定抗体法

  1 免疫与采血

  用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品以2倍稀释法稀释成3~5个适当稀释度,每一稀释度样品免疫体重10~14g小白鼠8只,皮下注射0.5ml,免疫5周后,每个小白鼠采血,分离血清,56℃30分钟灭活,放-20℃保存。

  2 毒素试验量测定

  Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素试验量采用Lcd/10000。

  在96孔培养板中用RPMI1640(或199)培养液将毒素做2倍系列稀释,每孔50μl,然后向各孔中加入50μl标准白喉抗毒素(0.0001IU),用胶带密封,在室温放置1小时后,加入50μlVero细胞悬液(见3项)密封,放37℃CO2孵箱培养6~7天后,观察结果,使细胞死亡的最大毒素稀释度孔(红色)就是Lcd/10000。

  Lcd/10000的毒素量约相当于1×10-4Lf的毒素适用于本试验。

  3 Vero细胞

  RPMI1640(或199)培养液(加青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml,胎牛血清10%)。Vero细胞培养于150cm2培养瓶中,待细胞长成占瓶底80%~100%单层时,弃去上层培养液,加10ml0.25%胰酶,放37℃数分钟,弃去胰酶,加入10ml培养液,打匀细胞进行计数(1瓶150cm2培养瓶大约可得10~40×106细胞)。用培养液调整细胞浓度至2.5×105细胞/ml。

  4 阳性对照小白鼠血清

  用吸附白喉类毒素免疫1批小白鼠,免疫5周后采血,分离血清,分装小管,冷冻干燥,保存于-20℃。

  5 抗体滴定

  按下图将培养板编号:

  A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

  B1

  C1

  D1

  E1

  F1

  G1

  H1

  (1)向每孔加入50μl培养液,但A11、A12和H11、H12孔不加,而G11、G12加100μl培养液。

  (2)取8份待检血清,分别加入A1至H1孔各50μl,横向进行2倍系列稀释,直至A10和H10孔。

  (3)将标准白喉抗毒素稀释至0.008IU/ml,加入A11、A12、B11和B12孔各50μl,从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。

  (4)H11和H12孔加入阳性小白鼠对照血清50μl。

  (5)除G11和G12孔外,向其余各孔中加入毒素(Ldc/10000)50μl,轻轻转动培养板,混匀,在培养板上贴上胶带将板孔封闭,放室温1小时。

  (6)收集Vero细胞,进行计数,并稀释成2.5×细胞/ml的Vero细胞悬液。

  (7)室温放置1小时之培养板,去胶带,立即加入50μlVero细胞悬液,再用胶带封闭培养板,放37℃CO2孵箱培养6天。在24小时及48小时检查胶带封闭情况,如出现封闭不严应更换。

  (8)培养6天后取出培养板,根据培养液颜色变化记录结果,黄色为(+),红色为(-),羲色不明显者则可用显微镜观察,如单层细胞完整无损则为(+),否则记录(-)。最终结果以打分表示,即变成黄色的最高稀释度孔的2的指数,例如:变黄的最后一孔是1/256即28,则结果记为8。

  6 试验要求

  E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度都出现(-),如果出现(+),则毒素量和细胞敏感度都很低,应重试。

  细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12必须是(+),如出现(-),应重视。

  Lcd/10000毒素量的准确性,根据以上计划下列各孔中所加标准抗毒素为:

  孔A11和A120.0004IU

  B11和B120.0002IU

  C11和C120.0001IU

  D11和D120.00005IU

  如毒素用量准确(Lcd/10000),则A11、A12和B11、B12孔应为(+),而C11、C12和D11、D12应为(-),否则应重试。

  7 结果计算

  用平行线分析法进行结果计算

  8 结果判定

  待检样品的效价每剂量应不少30IU。如95%可信限大于50%~200%,则95%可信限的低限效价应大于30IU/1个人用剂量。

(二)豚鼠毒素攻击法

  1 免疫及攻击

  用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品稀释成等比间隔的3~5个稀释度(中间的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物),每一稀释度样品免疫体重250~300g之豚鼠至少10只,另外5只豚鼠不注射作为对照。免疫后4周,每只免疫豚鼠攻击白喉毒素100LD50,皮下注射1.0ml。对照组健康动物注射100倍稀释之上述毒素,每只皮下注射1.0ml。攻击毒素后观察5日,每日记录结果。

  2 试验成立应具备的条件

  (1)检品的最低稀释度能保护半数以上动物。

  (2)检品的最高稀释度保护半数以下动物。

  (3)对照组动物应部分死亡而不全部死亡。

  (4)检品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上没有太大的偏差。

  3 结果计算及结果判定

  见Vero细胞法7和8项。

吸附精制白喉类毒素使用说明书

  本品系精制白喉类毒素经氢氧化铝吸附制成。用于预防白喉。

  本品为乳白色均匀混悬液,含防腐剂硫柳汞,长时间放置后吸附剂下沉,溶液上层应澄明无色,但经振摇后能均匀分散。

  接种对象

  主要为6个月~12周岁儿童。

  用法

  1.上臂三角肌肌内注射。

  2.剂量如下:

针 次 剂量(ml)
 

 

全程免疫

第1年 第1针

(间隔4~8周)

第2针

0.5

0.5

第2年 注射1针 0.5
加强免疫 3~5年后 加强1针 0.5

  禁忌

  患严重疾病、发热或有过敏史者及注射白喉类毒素后发生神经系统反应者应禁用。

  反应

  注射本品局部可有红肿、疼痛、发痒,或有低热、疲倦、头痛等,一般不需处理即行消退。

  注意事项

  1.使用时应充分摇匀,如出现摇不散之凝块、异物,安瓿有裂纹,制品曾经冻结,标签不清及过期失效者均不可使用。

  2.注射后局部可能有硬结,1~2个月即可吸收,注射第2针时应换另侧部位。

  3.应备1∶1000肾上腺素,供偶有发生休克时急救用。

  保存

  保存于2~8℃暗处,不可冻结。


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