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人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-16
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摘要: 人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程 本品系用狂犬病固定毒(aG)适应株接种原代地鼠肾单层细胞,培养后收获病毒液,加入甲醛溶液灭活后浓缩,再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。1 毒种来源 狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后,再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。2病毒滴定 aG毒种用体重......


人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程

  本品系用狂犬病固定毒(aG)适应株接种原代地鼠肾单层细胞,培养后收获病毒液,加入甲醛溶液灭活后浓缩,再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。

  1 毒种

  1.1 毒种来源

  狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后,再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG交替代。

  1.2 毒种检定

  1.2.1无菌试验

  aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验,合格者方可使用。

  1.2.2病毒滴定

  aG毒种用体重11~13g小白鼠进行脑内病毒滴定,滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。

  1.2.3纯毒试验

  生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验,以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问,应及时进行鉴定。

  1.3 毒种传代

  选择体重120~160g健康豚鼠,脑内注射,选潜伏期80~100小时具有典型狂犬病症状者放血致死,无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5代。

  1.4 毒种保存

  供生产用aG株在-60℃以下保存,不得超过1年。

  2 疫苗制造

  2.1 细胞制备

  2.1.1地鼠

  选用12~14日龄健康地鼠,如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。

  2.1.2解剖

  处死地鼠,用消毒液洗涤皮毛数次,末次浸泡一定时间,无菌取肾,置于瓶中剪碎。

  2.1.3细胞消化及分装

  将剪碎肾块洗涤数次,加入适量胰蛋白酶消化液,置2~8℃过夜(约16~20小时)或37℃水浴消化适当时间,弃去消化液,经洗液洗涤2~3次,振摇或吹打分散细胞,加入适量生长液,分装培养瓶,置37℃±0.5℃培养长成单层。

  2.1.4使用液体

  均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

  2.1.4.1生长液

  为含不超过10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液,可加入适量抗生素。

  2.1.4.2浸泡液

  为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液,其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白,可加入适量抗生素。

  2.1.4.3维持液

  为199或其他适宜的溶液,其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白,可加入适量抗生素。

  2.1.5外源因子检查

  每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外,细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察,应无病变发生。并用0.2%~0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验,置4~8℃30分钟判定结果;再置20~25℃30分钟再次判定结果,均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性,在同种细胞上继续盲传,如传出病毒,该批细胞制备的疫苗应予废弃。

  2.2 病毒接种和病毒液收获

  2.2.1病毒接种

  将长成单层细胞瓶倾去营养液,换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG株摇碎后,经1000r/min离心10分钟,吸取上清液按1∶1000~1∶4000种入细胞瓶,也可将细胞与病毒同时接种,置32~37℃继续培养。

  2.2.2洗换

  种毒后吸附适当时间倾去浸泡液,用Hanks液或其他适宜液体洗涤细胞,然后换入维持液,置32~37℃继续培育。

  2.2.3病毒液收获

  洗换后观察细胞生长情况,选择适当天数收获病毒液,取样品做病毒滴定及无菌试验。

  2.2.4病毒滴定

  将样品做10倍系列稀释,取3个稀释度的病毒液,每个稀释度用体重11~13g小白鼠4只,每只脑内接种0.03ml,逐日观察,14日判定结果,计算LD50(3日内死亡者不计)。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重试1次。

  2.3 灭活

  病毒液内加入1/4000~1/5000的甲醛溶液,置32~37℃或2~8℃或其他适宜温度灭活一定时间。

  2.4 过滤合并

  将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。

  2.5 防腐剂

  按0.005%~0.01%加入硫柳汞。

  2.6 超滤浓缩

  原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。

  3 疫苗剂型

  3.1 液体浓缩疫苗

  病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al(OH)3,使最终含量为0.4~ 0.7mg/ml。

  3.2 冻干浓缩疫苗

  用适当方法进行超滤或精制,然后冻干。

  3.2.1冻干保护剂

  1%明胶和5%蔗糖或其他适宜保护剂。

  3.2.2疫苗稀释

  将保护剂按比例加入疫苗内,充分摇匀,取样做冻干前无菌试验后立即分装与冻干。

  4 半成品检定

  4.1 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  4.2 灭活试验

  将样品脑内接种体重11~13g小白鼠10只,每只0.03ml,观察14天,应健存,非特异死亡不超过20%。小白鼠如发病死亡,可继续灭活并进行灭活试验。

  4.3 残余牛血清蛋白含量

  用检定所认可的试剂和方法测定,液体浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。

  5 分装

  半成品检定合格后即可进行分装。液体浓缩疫苗每支装量2ml,冻干浓缩疫苗每支装量1ml或2ml。

  6 成品检定

  6.1 效力试验

  由质量检定部门进行。

  6.1.1攻击毒株

  攻击毒株(CVS)由中国药品生物制品检定所发给。

  6.1.2击毒株的制备

  6.1.2.1启开冻干毒种:稀释成10-2悬液,用体重11~13g小白鼠,脑内接种0.03ml,连续传2~3代,收脑时应选择4~5天有典型狂病症状的脑组织,放-60℃低温保存。

  6.1.2.2病毒悬液的制备:将鼠脑研磨并加入适量正常马血清或小牛血清蒸馏水,制成20%悬液,经1000r/min沉淀10分钟,吸取上清液分装安瓿或小管,储存于-60℃冰箱中,经用体重18~20g小白鼠做病毒滴定,符合要求后,方可作攻击毒用。

  6.1.3疫苗参考对照品。

  由检定所定期发给。

  6.1.4待检疫苗

  取同批安全试验合格疫苗用pH7.6PBS做5倍连续稀释,一般采用3个稀释度以上进行免疫,如1∶5、1∶25、1∶125的稀释度。

  6.1.5免疫

  选用体重12~14g的小白鼠,免疫时应同时有参考对照品的对照和攻击病毒LD50测定的对照小白鼠,参考对照品可做1∶25、1∶125和1∶625共3个稀释度进行免疫,每只小白鼠腹腔注射0.5ml,间隔一周再免疫一次,免疫时将疫苗保存在冰浴中,各组小白鼠都应在同样的条件下饲养。

  6.1.6攻击

  小白鼠于第一次免疫后14天,用预先测定含5~100个LD50的病毒量脑内攻击0.03ml/只。病毒测定用10-0、10-1、10-2、10-3,每稀释度不少于8只,疫苗免疫组小白鼠每个稀释度为14~16只,所有小白鼠自攻击之日起观察14天。第5天后死亡和呈现典型脑病症状也作为因狂犬病死亡而计算在内。

  6.1.7判定结果和合格指标

  要求原病毒悬液注射的小白鼠80%以上死亡,攻击病毒含量为5~100个LD50。液体浓缩疫苗合格指标应≥2.5IU/安瓿(2ml),冻干浓缩疫苗应≥2.5IU/安瓿(1ml或2ml)。疫苗不合格可复试一次。

  6.2 物理检查

  液体浓缩疫苗应为橘红-紫红色混浊液体,久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。

  6.3 化学测定

  按《生物制品化学检定规程》进行。

  6.3.1 pH值

  pH值应为7.2~8.0。

  6.3.2氢氧化铝含量

  不得超过0.7mg/ml。

  6.3.3硫柳汞含量 

  不得超过0.01%。

  6.3.4游离甲醛含量

  不得超过0.015%。

  6.3.5水分

  冻干疫苗水分不得超过3.5%。

  6.4 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  6.5 毒性试验

  取疫苗接种11~13g小白鼠10只,每只腹腔注射0.5ml,观察7天,应健存。

  6.6 稀释液

  冻干浓缩疫苗用灭菌注射用水或其他适宜稀释液稀释,其质量应符合《中国药典》规定。

  7 保存与效期

  疫苗应保存于2~8℃。液体浓缩疫苗由效力合格之日起效期为1年,冻干浓缩疫苗由冻干之日起,效期为2年。

人用浓缩狂犬病疫苗使用说明书

  本疫苗为狂犬病固定毒(aG)适应株,接种于原代地鼠肾单层细胞,培养后收获病毒液,加入甲醛溶液灭活后浓缩,再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。

  液体浓缩疫苗为橘红色-紫红色微混浊液体,久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。含硫柳汞防腐剂。

  接种对象

  凡被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤时,应立即处理局部伤口(用肥皂水反复冲洗后,再用碘酊消毒数次),并及时注射本疫苗。

  用法

  1.一般咬伤者于0(第1天,注射当天)、3(第4天,以下类推)、7、14、30天各注射本疫苗1安瓿(液体疫苗2ml,冻干疫苗1ml或2ml),儿童用量相同。严重咬伤者(头、面颈、手指、多部位3处以上咬伤,咬穿皮肤或舔触粘膜者),应按上述方法注射本疫苗。并应于0、3天注射加倍量疫苗,并于0天注射疫苗的同时用抗狂犬病血清(40IU/kg)或狂犬病免疫球蛋白(20IU/kg)浸润咬伤局部和肌内注射。凡联合使用抗狂犬病血清或免疫球蛋白者,必须在全程疫苗注射完毕后再加强注射2~3针疫苗,即在全程注射后第15、75天或第10、20、90天加强。

  2.本疫苗供上臂三角肌肌内注射。儿童应在大腿前内侧区肌内注射。

  3.使用前将疫苗振摇成均匀悬液。冻干浓缩疫苗则加入等量灭菌注射用水溶解后,以无菌手续将疫苗吸入注射器内。

  4.对未咬伤健康者预防注射,可按0、7、21天注射3针。

  禁忌

  由于狂犬病是致死性疾病,疫苗注射无禁忌证。

  注意事项

  1.注射疫苗期间可照常工作,切忌饮酒、浓茶等刺激性食物及剧烈劳动等,以避免引起反应。

  2.伤口不宜包扎或缝合。

  保存

  应保存于2~8℃。


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