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吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程

来源:中国生物制品规程 作者: 2006-1-15
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摘要: 吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程 本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之用。1 百日咳菌苗原液应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2。1 配方 每ml制剂中各种抗原成份含量如下: 百日咳菌45亿~90亿 精制白......


吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合
制剂制造及检定规程

  本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之用。

  1 抗原要求

  1.1 百日咳菌苗原液应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4项的规定。

  1.2 精制白喉类毒素应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4项的要求。

  1.3 精制破伤风类毒素应符合《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4项的要求。

  2 制造

  2.1 配方

  每ml制剂中各种抗原成份含量如下:

  百日咳菌45亿~90亿

  精制白喉类毒素20Lf

  精制破伤风类毒素5Lf

  2.2 吸附剂配制,见《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》5项。

  2.3 氢氧化铝稀释

  以蒸馏水按吸附后之总量将氢氧化铝原液稀释成1.0~1.5mg /ml。硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml),氯化钠含量补足至0.85%(g /ml),高压蒸汽灭菌。

  2.4 吸附

  按计算量将精制白喉类毒素、精制破伤风类素及百日咳菌苗原液加入稀释好的吸附剂内。调节pH至5.8~7.2。

  2.5 分批

  同批吸附剂同批配合的原液同次吸附的制品为1批。如用大罐吸附时,所用抗原和吸附剂可以多批混合(精制类毒素不超过3批),每罐为1批。

  3 成品检定

  3.1 物理化学检查

  3.1.1 振摇后应呈均匀乳白色混悬液。不应有摇不散的凝块或异物。

  3.1.2pH值应为5.8~7.2。

  3.1.3 氯化钠含量为0.75%~0.9%(g /ml)。

  3.1.4 硫柳汞含量为1.0%~0.5%(mg /ml)。

  3.1.5 硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml)。

  3.2 鉴别试验

  抽取样品,另枸橼酸钠或用其他适宜方法将吸附剂溶解后,离心沉淀百日咳菌体和残留的吸附剂,按《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中7.6项、《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中7.6项和附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.3项进行鉴别试验。

  3.3 无菌试验

  按《生物制品无菌试验规程》进行。

  3.4 毒性试验

  应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.5项的规定。

  3.5 安全试验

  3.5.1 小白鼠法

  用体重18~20g之健康小白鼠5只,每只皮下注射检品0.5ml观察7日,不得有局部脓肿或死亡。

  3.5.2 豚鼠法

  用体得300~400g豚鼠,每批制品不少于4只,每只皮下注射2.5ml,分两侧,每侧1.25ml,应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4.4项及《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4.5项要求。

  3.6 效力试验

  3.6.1 百日咳菌苗免疫力试验

  每3批抽1批进行,应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中1.2.5项的规定。

  3.6.2 白喉及破伤风类毒素的效力试验

  每更换1批类毒素时进行。取体重300~400g豚鼠4只,每只皮下注射0.5ml,第30天采血,将分离的血清等量混合,进行白喉及破伤风抗毒素单位测定。

  3.6.2.1 白喉抗毒素单位测定

  用Lr /300家兔皮内法,要求每ml血清达到0.25IU。

  3.6.2.2 破伤风抗毒素单位测定

  用L+/100小白鼠皮下法,要求每ml血清达到0.5IU。

  3.6.2.3 白喉类毒素的效力试验亦可采用攻毒法。取体重300~350g豚鼠5只以上,每只皮下注射0.5ml。第30天各皮下攻击白喉毒素200个MLD,观察7天,豚鼠死亡不得超过20%;同时另取体重240~270g豚鼠3只,各皮下注射1个MLD毒素作为对照,2只对照豚鼠应发病并于96小时内死亡,允许另1只较晚死亡或发病。

  3.6.2.4 亦可按WHO推荐的效力检定方法(见《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》附录和《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》附录)。

  4 保存与效期

  应保存于2~8℃。自吸附之日起效期为1年半。

  附录1 百日咳菌苗原液制造及检定要求

  本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液,加适当杀菌剂,以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成,每ml含菌45亿~90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。

  1 菌种

  1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗,由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

  1.2 菌种检定

  1.2.1 培养特性

  于包-姜(Bordet-Gengou)氏或其他适宜的培养基上培育,各菌株应具有典型的形态及生化特性。

  1.2.2 血清学特性

  将35~37℃培育40~48小时的菌苔,混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内,使每ml含菌20亿个,与Ⅰ相血清做定量凝集反应,凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应,其型别应与该菌种标定型别相同。

  1.2.3皮肤坏死试验

  用健康家兔或豚鼠至少2只,用培育40~48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内,然后稀释为几个不同浓度的菌液,分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml,经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应,判为合格。

  1.2.4 毒力试验

  用体重16~18g之小白鼠至少3组,每组至少10只,在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40~48小时,以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天,记录小白鼠生死情况,按Reed Muench法计算LD50,LD50菌数不超过1.2亿判为合格。

  1.2.5 免疫力试验

  1.2.5.1 方法

  按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。

  1.2.5.2判定

  试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时,可复试,其结果的几何平均值(如用概率分析法时,应用加权几何平均值)≥4.0IU,仍判为合格。

  1.3 菌种保存

  1.3.1 菌种应用冻干法保存。

  1.3.2 冻干菌种应保存在2~8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查,合格的菌种可使用2年,以后每年检查1次,如仍合格可继续使用1年。

  2. 制造

  2.1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株,制成的菌苗应含1、2、3型因子。

  2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基,不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。

  2.3 原液制造

  2.3.1 菌种

  冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35~37℃培育不超过72小时,以后各代不超过48小时,传代菌种保存不得超过14天,冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。

  2.3.2 培育

  可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时,经检查为纯菌后,用适当方法收集菌体,混悬于pH值为7.0~7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。

  2.3.3 杀菌

  原液可用不超过0.1%(ml /ml)甲醛溶液杀菌,放37℃2~3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。

  2.3.4纯菌试验

  原液应逐瓶(罐)抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面(或活性炭半综合培养基)各1管,放35~37℃培育2天,然后放24~26℃1天。有杂菌生长者应废弃。

  2.3.5 原液合并

  固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后,可加适量防腐剂,并保存于2~8℃。

  2.4 原液检定

  2.4.1 浓度测定

  每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。

  2.4.2 镜检

  每瓶原液取样稀释至成品浓度,涂片染色镜检,应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野,应无杂菌。

  2.4.3 凝集反应

  每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验,其凝集效价应达血清原效价之半,如仅达到或低于血清原效价1/4时,应作免疫力试验,合格后方可使用;同时应用单价分型血清做定性凝集试验,其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。

  2.4.4 无菌试验

  每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外,并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长,可复试一次,若仍有百日咳菌生长,原液应判为不合格。

  2.4.5 毒性试验

  2.4.5.1方法

  按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。

  2.4.5.2 判定

  试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重,第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%,并不得有死亡,该批原液毒性试验判为合格。

  试验结果达不到上述要求,可复试一次。仍达到不过要求,可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。

  2.5 原液保存

  应保存于2~8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。

附录2 百日咳菌苗原液免疫力试验方法

  1 免疫

  1.1 动物

  选用体重10~12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。

  将动物随机分为三组,每组16只或20只(同性或雌雄性各半,为保证攻击后有16只或20只小白鼠,可适当多免疫几只小白鼠),同时饲养健康小白鼠55只,备做对照用。

  1.2 免疫原稀释

  将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2,然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×,百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU,然后再稀释成每ml含1.0IU(0.125ml)、0.2IU(0.025ml)及0.04IU(0.005ml)。

  1.3 免疫方法

  将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠,每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。

  2 攻击菌及攻击菌液的制备

  2.1 菌种

  小白鼠脑内攻击用58030(18323)菌株。

  2.2 培养基

  可用包-姜氏培养基(含羊血20%~30%)或其他适宜的培养基。

  2.3 培养温度及时间

  放35~37℃培育,第一代不超过72小时,攻击时菌种的培育时间为20~24小时。原代菌种放2~8℃可保存2周。

  2.4攻击菌液的制备

  将培育20~24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后,刮入生理盐水或pH7.3±0.1缓冲生理盐水,用灭菌脱脂棉过滤,测定浓度,然后用pH7.0~7.2水解酷素、蛋白胨水或肉汤稀释成每0.03ml含菌8万,作为试验组的攻击菌液,然后再连续稀释,使每0.03ml分别含8000、800、80及8个菌,以上5个不同稀释度的菌液,作为对照组的攻击菌液。

  2.5 工作起止时间

  自攻击菌液制备(开始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。

  2.6活菌计数

  在攻击前后,可将0.03ml含8个菌的攻击菌液,接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中,每个平皿0.2ml,每次不得少于2个平皿,其菌落形成单位约为浊度测定的1/4。

  3 攻击

  动物免疫后14天,每只小白鼠脑内攻击0.03ml菌液(含8万个菌),用0.25ml注射器,4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定,对照组每稀释度攻击10只小白鼠。

  4 记录结果

  动物攻击后观察14天。攻击后第2天,将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数,最初3天死亡的动物不作统计,至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。

  5 结果计算 

  5.1 按Wilson-Worcester氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED50±SD%,每个ED50标准差的范围一般应为64%~156%。

  5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组LD50,1个LD50的菌数应不高于800个菌。

  5.3 计算均质性因子“α”。

  5.4IU计算

  待检原液每ml应含IU=参考菌苗ED50/待检原液ED50×参考菌苗每ml的IU数

  6 效力评价

  百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后,每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。

附录3 百日咳菌苗原液毒性试验方法

  1 选用体重14~16g健康小白鼠,每批原液不少于10只(同性或雌雄性各半)。

  2 以灭菌生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水(含成品菌苗相同量的防腐剂),将百日咳原液稀释至成品菌苗浓度的1/2。

  3 每只小白鼠腹腔注射稀释的原液0.5ml。另取同数量同体重的小白鼠(同性或雌雄性各半),腹腔注射稀释用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水0.5ml作为对照。

  4 注射后的小白鼠应逐日观察,并于喂食后2小时进行称重。

  5 于注射前、注射后72小时及7天,分别称试验组及时对照组小白鼠的体重。

  6 试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前的总体重;7天小白鼠平均增加的体重不少于对照组平均增加体重的60%,并不得有死亡,该批原液毒性试验判为合格。

  7 试验结果若达不到上述要求,可进行复试,仍达不到上述要求,原液可放置2~8℃保存3~4个月再进行复试,如仍达不到上述要求,该批原液的毒性判为不合格。

吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂使用说明书

  本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。每ml中含百日咳菌8个效力单位,精制白喉类毒素20Lf、精制破伤风类毒素5Lf。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之日。

  本品为乳白色悬液,含硫柳汞防腐剂,放置后菌体易下沉,但经振摇后能均匀分散。

  接种对象

  3个月~6周岁儿童。

  用法

  1.臀部外上方1/4处或上臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后肌内注射。

  2.免疫程序与剂量

  自3月龄开始免疫,至12月龄完成三针次免疫,每针间隔4~6周。18~24月龄注射第4针。每次注射剂量为0.5ml。

  禁忌

  有癫痫、神经系统疾患及抽风史者禁用。急性传染病(包括恢复期)及发热者暂缓注射。

  反应

  注射本品后,局部可有红肿、疼痛、发痒,或有低热、疲倦、头痛等,一般不须特殊处理即行消退,如有严重反应应及时诊治。

  注意事项

  1.使用时应充分摇匀,如出现摇不散之凝块,有异物,安瓿有裂纹,制品曾经冻结,标签不清和过期失效者不可使用。

  2.注射后,局部可能有硬结,可逐步吸收。注射第2针时应更换另侧部位。

  3.应备1∶1000肾上腺素,供偶有发生休克时急救用。

  4.注射第一针后出现高热、惊厥等异常情况者,不再注射第二针。

  保存

  应保存于2~8℃暗处,不得冻结。


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