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第二节PCR技术的原理

来源:实用免疫细胞与核酸 作者: 2006-1-13
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摘要: 第二节PCR技术的原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩......


第二节 PCR技术的原理

  PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。

图22-1 PCR基本原理示意图

  假设扩增效率为“X”,循环数为“n”,则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为:y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时,若X=100%,则y=230=1073741824(>109);而若X=80%时,则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见,其扩增的倍数是巨大的,将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灶照射下(254nm)一般都可见到DNA的特异扩增区带。


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