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第四节原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法

来源:实用免疫细胞与核酸 作者: 2006-1-13
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摘要: 但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失,如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。 一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序 (1)切片入PBS冲洗5min,最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。1mol/L 甘氨酸PBs 5min。4%Triton X-100 PBS 15min。...


第四节 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法

  原位杂交组化(ISHH)与免疫组织化学(IHC)结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色,这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原,从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色,也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果,易成功,但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差,但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色,使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解,因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色,这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失,如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。

  一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

  (1)切片入PBS冲洗5min,最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

  (2)0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

  (3)0.4%Triton X-100 PBS 15min。

  (4)1μg/ml蛋白酶K,37℃保温30min。

  (5)4%多聚甲醛PBS固定5min 。

  (6)PBS冲洗2×3min。

  (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L 三乙醇胺配)10min。

  (8)2×SSC冲洗10min。

  (9)杂交:如是cDNA探针用前需进行变性处理,载片法时将切片在空气中晾干,加含探针的杂交液10μl于切片上,盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜,3H标记探针每10μl杂交液含1×105cpm探针,32P或35S标记探针每10μl杂交液含5×105cpm探针;如是漂浮切片,则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干,然后入杂交液,探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12~16h。

  (10)4×SSc 37℃冲洗10~30min。

  (11)2×SSC(如为RNA探针则含20μg/ml RNase)37℃冲洗30min。

  (12)1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

  (13)PBS冲洗2×5min。(转录ISHH)

  (14)0.5%H2O2 PBS室温30min。

  (15)1%BSA 37℃,30min 。

  (16)第一抗体,4℃孵育16~24h。

  (17)PBS冲洗4×5min。

  (18)第二抗体37℃,1h。

  (19)PBS冲洗3×5min。

  (20)兔PAp 37℃,1h 。

  (21)PBS冲洗3×5min。

  (22)DAB显色液5~10min(DAB显色液:0.05%DAB + 0.03% H2O2 PBS液配)。

  (23)PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上,晾干。

  (24)切片入70%,85%,95%和2个100%酒精脱水,空气干燥。

  (25)在暗室涂布乳胶(乳胶配制:乳胶原液:0.6mol/L醋酸胺=1:1),晾干,装入自显影暗盒。

  (26)4℃曝光3H标记探针4~8周,35S标记探针1~4周,32P标记探针7~10天。

  (27)D196显影液,20℃显影5~10min。

  (28)自来水冲洗数秒。

  (29)F5坚膜定影液10min。

  (30)自来水冲洗15min。

  (31)切片温箱烤干,脱水,透明,封片。

  结果:蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质,而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。

  二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

  非同位素标记物很多例如:生物素(biotin),地高辛(Digoxigenin),汞(mercury),溴(bromine)和碱性磷酸酶等,其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化PAP法或ABC法联合使用,能成功地显示一些神经肽mRNA和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的,只有抗体的Fab段没有Fc段,而免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)所应用的抗体既有Fab段,又有Fc段。由于抗体的这一特性可在ISHH和ICC抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起,一同孵育切片,这样可明显缩短ISHH和ICC结合法的实验周期,同时还可以减少实验过程中对ICC检测的蛋白、多肽的损害,使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片,这是因为抗地高辛抗体只有Fab段,而没有Fc段。我们知道抗体的抗原决定簇在Fc段,因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的Fab与第一抗体的Fc,所以第一抗体如果只有Fab段没有Fc段,那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图(图20-5)。

图20-5 原位杂交细胞化学与免疫细胞化学结合法

  此种ISHH与ICC联合法稳定,实验周期短,蓝色与棕色反差强,是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下:

  (1)将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。

  (2)0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。

  (3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。

  (4)1μg./ml蛋白酶K(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配),37℃保温30min。

  (5)4%多聚甲醛PBs 5min。

  (6)PBS冲洗2×min。

  (7)0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配)10min。

  (8)2×SSC冲洗10min。

  (9)将切片用灭菌吸水纸吸干,然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25~0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12~16h。

  (10)4×SSc 37℃冲洗30min。

  (11)2×SSC(含RNasea 20μg/ml)37℃保温30min。

  (12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。

  (13)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

  (14)0.5%H2O2 PBS室温20min。

  (15)0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。

  (16)碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体(Fab)与抗蛋白或多肽等抗体混合液,前者一般1:1000稀释,后者则因抗体而异。稀释液:1%BSA,0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2,4℃孵育24h。

  (17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

  (18)二抗(1:100~1:200)37℃保温1h。

  (19)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

  (20)PAP(1:200~1:400)37℃保温1h。

  (21)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

  (22)DAB显色液(0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配)显色5~10min。

  (23)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

  (24)TSM,冲洗2×5min(TSM1:0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2).

  (25)硝基四氮唑蓝(400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸(200μg/ml)混合液(TSM2配显色混合液)显色1~3h,避光。

  (26)20mmol/l EDTA终止显色。

  (27)将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上,空气干燥。

  (28)梯度酒精脱水,透明、封片。

  结果:ISHH阳性细胞的胞质呈紫蓝色,胞核不着色,示该细胞含XmRNA。ICC阳性细胞的胞质呈棕色,胞核不着色示该细胞含X多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色,示多肽与mR-NA共存于该细胞内。


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