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第一节抗原的制备

来源:实用免疫细胞与核酸 作者: 2006-1-13
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摘要: 由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质,有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质,以供科学研究之用。 一、抗原的提取 抗原的制备是一件十分细致的工作,要制备一个高纯度的抗原,需要付出艰巨的努力,制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不......


第一节 抗原的制备

  除完整的细胞可作为抗原外,各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质,也都具有全抗原或半抗原的性质,某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的,可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质,有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质,以供科学研究之用。

  一、抗原的提取

  抗原的制备是一件十分细致的工作,要制备一个高纯度的抗原,需要付出艰巨的努力,制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面:①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中,如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等;②把混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的,如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质,其分离方法也不一样,就是同一类大分子物质,因选材不同,所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用,所以在提取前必须针对所欲提取的物质,充分查阅文献资料,选用合适的方法。如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质,更需要经过各种方法的比较探索,才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

  抗原物质的制备,大概要经过如下过程:①材料的选择和预处理;②细胞的粉碎(细胞器的分离)。③提取;④纯化;⑤浓缩或干燥,保存。现分别简述如下。

  (一)材料的选择及预处理

  选择什么材料主要根据实验目的而定。通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。材料选定后,通常要进行预处理,剔除结缔组织、脂肪组织等,把组织块剪碎。若取材后不立即进行提取,则应冷冻保存,动物组织更要深低温保存。某些容易失活的物质,一般宜采用新鲜材料。

  (二)细胞的粉碎

  除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外,凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质,都必须把组织和细胞粉碎,使活性物质充分释放到溶液内。不同的组织,细胞的破碎难易不一,因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如脑、胰、肝等比较软嫩的组织,用普通匀浆器研磨就行,肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。

  1.物理法

  (1)高速组织捣碎机:通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。把材料放于筒内(约占筒内容积的1/3)固定筒盖,开动马达,调速器由慢逐渐增至所需速度。此法适用于内脏组织。

  (2)玻璃匀浆器:由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状(球面经过磨砂)玻璃研杆组成。把绞碎的组织置于管内,加适量溶液,插入研杆,用手或电动转动研杆,并上下移动。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,对大分子的破坏也少。是粉碎少量软嫩材料(脑、胰、肝等)时常用的方法。

  (3)超声波处理法:多用于软嫩组织,根据不同组织采用不同频率,处理10~15min,超声波处理时溶液温度升高,使不耐热的物质失活,使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工降温,避免溶液内存在气泡。核酸及某些酶对超声波很敏感,要慎用。

  (4)反复冻融法:把待碎样品冷却到零下15~20。C,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。

  (5)冷热交替法:把材料投入90。C左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。

  2.化学和生物化学法

  (1)自溶法:把新鲜材料置于一定的pH和适宜的温度下,利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏,使细胞内容物释放出来。动物材料的自溶温度选在0~4℃,需加少量防腐剂,自溶时间较长,不易控制,不常用。

  (2)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶,37℃,保温10min,细胞就破坏了。此外,蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。

  (3)表面活性剂处理法:较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

  (三)抗原的提取

  提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。但一般说来,提取是指在分离纯化前期,将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中,让被提取物充分地释放出来的过程,而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中,如在制备核酸过程中,用氯仿反复提取蛋白液,用苯酚反复抽提分离DNA和RNA。影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的pH值使溶解度增加。因此,在不同的抗原提取过程中,所选用的溶剂的性质、pH值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。要达到分离提纯的目的,必须灵活地应用这些因素。

  现将蛋白质、核酸、多肽等抗原(半抗原)的提取方法概要叙述于下。

  1.蛋白质和酶的提取  蛋白质是由许多氨基酸连接而成的高分子物质,分子量从数千至百万。数以千计的蛋白质,按它们的功能可分成两大类,一类是活性蛋白,包括酶、激素蛋白、受体蛋白、运动蛋白、运输和贮存蛋白、防御蛋白等等,另一类是非活性蛋白,如胶原蛋白、角蛋白等,不同的蛋白质由于其结构的差异,它们溶解度也各不相同。大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于有机溶剂乙醇、丙酮、丁醇等。这对选择撮蛋白质的溶剂具有重要意义。

  (1)水溶液提取:由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液,因此提取蛋白质以水溶液为主,其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好,溶解度大,氢是最常用的溶剂。应注意下列几点:①盐浓度,常用等渗溶液,尤以0.02~0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液应用较多。如酵母脱氢酶以0.66mol/L磷酸氢二钠溶液提取,6-磷酸葡萄糖脱氢酶以0.1mol/L碳酸氢钠液提取,脱氧核糖核蛋白在低盐溶液中溶解度小,就要用1mol/L以上的氯化钠液提取,而某些脂肪酶,用水提取比低盐溶液提取效果更好。②pH值的选择对蛋白质提取颇为重要,因为蛋白质的溶解度和稳定性与pH值关系很大。提取液的pH值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内,通常在等电点的两侧,碱性蛋白如细胞色素C和溶菌酶选在偏酸一侧,酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶应选在偏碱一侧。③温度:为防止活性蛋白变性、降解而失活,温度通常选在5℃以下。对少数耐温的蛋白质和酶,可适当提高温度,使杂蛋白变性分离,有利于提纯,如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素可选择37~50℃条件下提取,效果比低温提取更好。

  (2)有机溶剂提取:一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液的蛋白质和酶,常用不同比例的有机溶剂来提取。如用70%~80%乙醇提取麸蛋白;用60%~70%的酸性乙醇提取胰岛素,既可抑制水解酶对胰岛素的破坏,又可除去大量杂蛋白,用丁醇提取某些附于微粒体和线粒体的酶,一些与脂质结合牢固的蛋白质和酶以丁醇提取,效果较好。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸脂酶。丁醇提取法对pH及温度的选择范围较广(Ph3~10),温度由零下2℃~40℃均可。

  2.核酸的提取  核酸分为两大类:一类为核糖核酸(RNA),另一类为脱氧核糖核酸(DND)。核酸的分子量极大,人数万致亿万。核酸是两性化合物,在一定的等电点。溶于水,其水溶液呈酸性,不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别,有一定浓度范围的氯化钠溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降,当氯化钠浓度为0.14mol/L时,其溶解度仅为水中溶解度的1/100,但当氯化钠浓度再增加时,脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加,氯化钠浓度增加到0.5mol/L时,其溶解度与水中溶解度相似,当氯化钠浓度增加到1mol/L时,它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度,因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白,而提取脱氧核糖核蛋白时,则用1mol/L氯化钠溶液。两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。当pH为4.2时,脱氧糖核蛋白的溶解度最低,而pH为2.0~2.5时,核糖核蛋白的溶解度最低。所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值,可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。

  (1)RNA的提取:RNA在细胞中主要有三种类型,即rRNA(核微粒核糖核酸)、tRNA(转移核糖核酸)和mRNA(信使核糖核酸)。mRNA代谢极不稳定,提取时要求条件较严格;tRNA当细胞破碎后,用酸处理得到“pH5”沉淀,即可从中分离tRNA;rRNA占全部RNA的80%以上,比较稳定,一般提取的大分子RNA主要为此部分。核内rRNA常先将细胞核分离后,再进行提取,可避免其他细胞组分RNA的干扰。

  RNA的提取,通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白,而留下含有DNA的细胞核物质,然后用10%醋酸调至pH4.2沉淀,离心弃去上清液,先用0.5mol/L氯化钠溶液,后用水洗涤沉淀,将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中,离心,取上清液,调pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化钠溶液洗涤,再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去,核酸留在碳酸氢钠水溶液中,加入乙醇,RNA即以钠盐形式沉淀出来。

  提取RNA另一类方法,不须事先用0.14mol/L氯化钠提取核糖核蛋白,而一步将RNA的蛋白质分开,并同时把RNA抽提出来,此类方法是在破碎细胞做成匀浆时,加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠;而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡,DNA和蛋白质沉淀于酚层中,水层中含RNA和多糖,然后用乙醇使RNA沉淀,四种物质一步便可初步分离开。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法,其应用举例如下:

  肝脏rRNA的提取:按肝重(鲜)加入10倍容积苯酚-甲酚混合液(500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸馏水中,另加入0.5g 8-羟基喹啉配成)及10倍容积的0.5%萘-1,5-二磺酸水溶液(g/V)做匀浆后在20℃搅拌20min。

  肝脏细胞核内mRNA的提取:先分离细胞核,再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液(g/V)中匀浆后加入等量90%(g/V)苯酚水溶液(内含0.1%8-羟基喹啉)在2℃振荡提取30min。

  酵母tRNA的提取:100g酵母(湿重)加入200ml水,300ml 90%苯酚水溶液,振荡2h,4℃冰箱中过液,使之提取完全。

  以上介绍了用冷酚法提取各种RNA的一些实例,近来还有皂土酚法(即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质)提取RNA,据报道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但应用苯酚法提取核酸时,须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质,可能导致核酸降解,使用时,一般需要减压重蒸。

  (2)DNA的提取:DNA主要存在于细胞核中,天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。人细胞中提取DNA时,一般先获得脱氧核糖核蛋白,再将蛋白质除去,从中分离DNA。常用的方法是以1mol/L氯化钠溶液抽提,得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡,除去蛋白质。或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L氯化钠加0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白,再以1mol/L氯化钠提取脱氧核糖核蛋白,提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白质。两种方法比较,后一种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时,加入适量去污剂更有助于蛋白质与DNA的分离。

  应用苯酚法也可以提取DNA而且不用经过脱氧核糖核蛋白这一步骤,例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内,加入同体积90%苯酚水溶液,室温下提取1h,再经进一步提纯可获得98%~99%纯度的DNA。苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。

  3.活性多肽及递质的提取大体上与蛋白质的提取方法相似,可参照进行。经典神经递质如去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等均可化学合成,无需用很多精力去提取。

  (四)抗原的分离与纯化

  从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的,必须进一步分离纯化才能获得纯品。在生物大分子制备工作中,分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。对于异类的物质,如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸,提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖,一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理,小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。而对同类物质,如酶和杂蛋白,RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离,情况则复杂得多,主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多;有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多;柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。本节 侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙述。

  1.蛋白质分离纯化的一些方法

  (1)盐析法

  ①原理:盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的,也是蛋白质和酶提纯工作应用最早,至今仍广泛使用的方法。其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加(此时称为盐溶);当盐浓度不断上升时,蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出,称为蛋白质的盐析。这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力,当水中加入少量盐类时,由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响,使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时,蛋白质表面的电荷大量被中和,水化膜被破坏,于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

  ②盐的选择:蛋白质盐析常用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵,其优点是温度系数小而溶解度大(25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L,即676g/L),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来,而且硫酸铵价廉易得,分段效果比其他盐好,不容易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时,对蛋白氮的测定有干扰,缓冲能力比较差,故有时也应用硫酸钠,如盐析免疫球蛋白,用硫酸钠的效果也不错,硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好,但也由于溶解度太低,受温度影响大,故应用不广。

  硫酸铵浓溶液的pH在4.5~5.5之间,市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸,pH值往往降至4.5以下,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节 。

  ③硫酸铵饱和度计算法及加入方式:在分段盐析时,加盐浓度一般以饱和度表示,饱和溶液的饱和度定为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。一是当蛋白质溶液体积不大,所需调整的浓度不高时,可加入饱和硫酸铵溶液;饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵,热至50~60℃保温数分钟,趁热滤去沉淀,再在0℃或25℃下平衡1~2天,有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算:

  式中V及V0分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积,S2及S1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说,混合不同体积的溶液时,总体积会发生变化使上式造成误差,但这由体积改变所造成的误差一般小于2%。故可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时,可直接加入固体硫酸铵,其加入量可按下式计算:

  式中X是将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量(g),G及A为常数,与温度有关。G在0℃时为707,20℃时为0.29。为方便起见,在室温及℃时所需硫酸铵的饱和度可直接查表2-1、表2-2求出。

表2-1 室温下由S1提高到S2时每升加固体硫酸铵的克数

  0.10 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
0 55 113 114 175 209 242 278 312 350 390 430 474 519 560 608 657 708 760
0.10   57 67 118 149 182 215 250 287 325 365 405 448 494 530 585 634 685
0.20     29 59 90 121 154 188 225 260 298 337 379 420 465 512 559 610
0.25       29 60 91 123 157 192 228 265 304 345 386 430 475 521 571
0.30         30 61 93 125 160 195 232 270 310 351 394 439 485 533
0.35           30 62 94 128 163 199 235 275 315 358 403 449 495
0.40             31 63 96 131 166 205 240 280 322 365 410 458
0.45               31 64 98 133 169 206 245 286 330 373 420
0.50                 32 63 100 135 172 211 250 292 335 380
0.55                   33 66 101 138 176 214 255 298 344
0.60                     33 67 103 140 179 219 261 305
0.65                       34 69 105 143 182 224 267
0.70                         34 70 108 146 187 228
0.75                           35 72 110 149 170
0.80                             36 73 112 152
0.85                               37 75 114
0.90                                 37 76
0.95                                   38

  ④盐析时注意的几个问题

  1)盐的饱和度:盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素,不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时,盐的饱和度常由稀到浓渐次增加,每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后,再继续增加盐的饱和度,使第二种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质,饱和度达20%时,纤维蛋白原首先析出;饱和度增至28%~33%时,优球蛋白析出;饱和度再增至33%~50%时,拟球蛋白析出;饱和度大于50%以上时,白蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法,从牛胰中酸性提取分离可得到九种以上蛋白质及酶。

  2)pH值:在等电点时,蛋白质溶解度最小容易沉淀析出,因此,盐析时除个别情况外,pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。

  3)蛋白质浓度:在相同盐析条件下,蛋白质浓度越大越易沉淀,使用盐的饱和度的极限愈低,如血清球蛋白的溶度从0.5%增到3.0%时,需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%。某一蛋白质欲进行两次盐析时,第1次由于浓度较稀,盐析分段范围较宽,第2次则逐渐收窄,例如用硫酸铵盐析胆碱酯酶时,第1次硫酸铵饱和度为35%至60%,第2次为40%至60%。蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利,但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用,因此,必须选择适当浓度,尽可能避免共沉作用的干扰。

表2-2 0℃下由S1提高到S2时每100ml加固体硫酸铵的克数

溶液的原始饱和度(%) 饱和度 在0℃时所达到硫酸铵饱和度(%)
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数
0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7
5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2
10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7
15 2.6 5.4 6.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2
20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7
25   0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2
30     0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8
35       0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3
40         0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8
45           0 2.9 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3
50             0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8
55               0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.1 23.5 27.3 31.3
60                 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.9 27.9
65                   0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 21.4
70                     0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9
75                       0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4
80                         0 3.3 6.7 10.3 13.9
85                           0 3.4 6.8 10.5
90                             0 3.4 7.0
95                               0 3.5
100                                 0

  4)温度:由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用,盐析操作一般可在室温下进行,至于某些对热特别敏感的酶,则宜维持低温条件。虽然蛋白质在盐析时对温度要求不太严格,但在中性盐下结晶纯化时,温度影响则比较明显。

  5)脱盐:蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后,常需脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析法,如图2-1所示:把蛋白质溶液装入透析袋中,袋的二端用线扎紧,然后用蒸馏水或缓冲液进行透析,这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中,蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内,通过不断更换蒸馏水或缓冲液,直至袋内盐分透析完毕。透析需要较长时间,常在低温下进行,并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。

  此外用葡聚糖凝胶脱盐的效果也很好,其原理和应用方法在这里不赘述。

图2-1 透析装置图

  (2)有机溶剂沉淀法:有机溶剂能降低溶液的电解常数,从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力,导致溶解度的降低;另外,有机溶剂与水的作用,能破坏蛋白质的水化膜,故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法,称“有机溶剂分段沉淀法”,它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活,操作必须在低温下进行,并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降,分离后的蛋白质沉淀,应立即用水或缓冲液溶解,以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近,有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度,减少变性,提高分离的效果,在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右,中性盐过多不仅耗费有机溶剂,可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好,溶剂易除去;缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质,使用有机溶剂沉淀尤其要小心。

  (3)等电点沉淀法:利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特别进行分离的方法,称为等电点沉淀法。但在等电点时,各种蛋白质仍有一定的溶解度而使沉淀不完全,同时许多蛋白质的等电点十分接近,故单独使用此法效果不理想,分辨力也差。大多用于提取后去除杂蛋白,即利用变动提取液的pH值使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉淀出。实际工作中常把等电点沉淀和盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用。

  (4)吸附法:在蛋白质的提纯方法中,选择性吸附也是应用历史较久迄今仍在广泛采用的方法之一。早期工作常用高岭土 (我国的一种土质,其分子式大致是AL2O3·2SiO2·2H2O)、氧化铝(AL2O3)及活性炭等吸附剂,由于这些吸附剂吸附力较弱,或者易引起蛋白质变性而应用不广,现已为凝胶性吸附剂所代替,如氢氧化铝凝胶和磷酸钙凝胶,尤其后者使用最广。吸附剂的应用有两种不同方式。当蛋白质较易吸附时,可以选择适当条件主要吸附蛋白质而分离去杂质;当蛋白质较难吸附时,则选择利于吸附杂质条件将杂质与蛋白质分开。有时两种方法可先后使用,以达到较高的提纯目的。吸附条件通常在微酸性条件(pH5~6)及稀盐溶液中进行,盐浓度过高会干扰对蛋白质及酶的吸附,亦即是说需要用更多量的吸附剂才能达到一定结果。洗脱时一般在弱碱条件下或适当提高洗脱液离子强度,可将吸附的蛋白质或酶完全洗脱下来。

  吸附操作可以用静态吸附,也可以用柱层析吸附,即将凝胶装成柱进行吸附操作。凝胶装柱后如溶液的通过能力很差,可用助滤剂(如硅藻土)和凝胶混合,当调整二者的比例时得到一系列通过能力和吸附能力不同的层析柱。最近还使羟基磷灰石[Ca10(PO4)6.(OH)2]分离蛋白质和酶,它可以在高盐浓度下吸附中性及酸性蛋白质而排除碱性蛋白质。吸附常在pH6.8的磷酸缓冲液中进行。洗脱完全时凝胶可反复使用3~4次,吸附杂质较多的凝胶以0.1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸洗净后再用。

  (5)离子交换法:蛋白质和酶都具有电解质性质,故可用离子交换剂进行分离提纯,特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著。有关离子交换剂及其使用技术,参阅有关专著,这里介绍近年来以纤维素衍生物作为离子交换剂纯化蛋白质及酶的方法。在这类衍生物中以二乙氨基乙基纤维素(简称DEAE-纤维素,为阴离子交换剂)及甲基纤维素(简称CM-纤维素,为阳离子交换剂)应用最广泛。

  DEAE-纤维素是纤维素结构中的氢原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱碱性化合物,它作为阴离子交换剂的原理是:

  在实际工作中常用磷酸缓冲液平衡DEAE-纤维素后,才对蛋白质进行交换吸附的,故上式B-可视为PO3-。用DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为7~9,然后提高盐浓度(使蛋白质与交换剂的结合键减弱)或降低pH使之洗脱,洗脱后的蛋白质溶液有时可进一步上CM-纤维素柱纯化。作为阳离子交换剂,CM-纤维素吸附蛋白质的原理如下:

  式中A+可为H+或Na+,视平衡CM-纤维素时所用溶剂而定。CM-纤维素常选在pH4.5~6.0左右吸附蛋白质,然后提高pH或盐浓度进行洗脱。离子交换纤维素对大分子物质有较大交换量,例如CM-纤维素对血红蛋白的交换量为93~98mg/100mgCM-纤维素。此外,纤维素离子交换剂还具有层析条件温和、物质易于洗脱、分辨力强、被分离的蛋白质不易变性等优点。

  除了纤维素离子交换剂外,离子交换凝胶也是目前应用于分离蛋白质和酶的一种很好的离子交换剂。常用的有DEAE-葡聚糖凝胶和CM-葡聚糖凝胶。离子交换凝胶不仅具有交换当量高、层析条件温和、操作简便等优点,而且兼具分子筛的性能,在梯度洗脱时,对不同分子量的蛋白质具有很高的分辨能力。

  2.核酸的分离纯化  从细胞中提取核酸后,仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程,也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时,为防止核酸大分子的变性降解,必须在0~4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用,是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍,现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+,就可以抑制核酸酶的活性,保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法,分别介绍如下:

  (1)肝糖元、淀粉及粘多糖,由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处,常在提取液中残存下来。除去的方法常有:①取材前尽量减少组织中多糖的含量,如先使动物饥饿数天然后杀死,可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶,将大分子多糖分解为小分子,在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下,以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液,使多糖溶于下层水相,核酸在上面有机层中。④以钙盐沉淀DNA,再以草酸钾处理,使之形成DNA钾盐回收,然后用离子交换法吸附DNA,使之与多糖分离。

  (2)蛋白质的除去:由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在,不论采用哪种方法提取核酸,蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此,除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种:①加入去污剂如硫酸十二脂钠,从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用,效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提,蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶,离心后除去,核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提,在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下,DNA或RNA都可以进入水相,蛋白质则沉淀于酚层,然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA,残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。

  (3)不同类型核酸的分离:两种类型核酸的制备过程中,DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似,而且分子量都十分大,所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有:①核糖核酸酸酶选择地破坏RNA,这是比较有效的方法,但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶,必须事先加热处理除去,然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟,就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀:在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液,使DNA与RNA均成为钙盐后,再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出,RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。③活性炭吸附:将处理好的活性炭按1/15~1/20体积加入每毫升含有0.5~1mgDNA溶液中,0~4。C下搅拌1h ,以31000×g离心1h,除去RNA后的DNA回收率可达94%。

  在RNA制品中除去DNA,苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下,以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA,可以除去绝大部分DNA。此外,也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理,破坏DNA,或参考上述DNA与RNA分离方法将DNA除去。

  (4)同类核酸的分离

  ①RNA混合物的分离:经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时,多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后,以不同梯度氯化钠溶液洗脱,或用蔗糖梯度(顶部5%浓度,底部20%浓度)离心法分开。mRNA的代谢速度较快,在细菌中平均寿命为90min,在哺乳动物中约为几小时至十几小时,常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时,由于共沉作用,常混有mRNA,一般可用萘-1,5-二磺酸处理,使二者分开。各种tRNA的提纯,通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行,分离效果较好。

  ②DNA混合物的分离:主要是变性或降解的DNA和天然的分离,常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析,逆流分溶,梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准:不含有蛋白质及多糖;不含有可透析的小分子杂物;在pH7时紫外吸收最大值在257~261μm之间,E(P)在6600左右;不含有RNA;固体为纤维状,水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用;具有电泳均一性及超离心中单分散性;具有生物活性。

  (五)抗原的浓缩

  浓缩是低浓度溶液通过除去溶剂(包括水)变为高浓度溶液的过程,在制备生物大分子及各种生化产品时,常在提取后和结晶前进行浓缩,有时也贯穿在整个制备过程中。沉淀(包括盐析和有机溶剂沉淀),广义上来说也是一种浓缩方法,经过沉淀再溶解,浓度可大大提高,但有时提取液很稀,体积又很大或结晶前除去少量溶剂,则常用其他方法浓缩。

  1.蒸发法 液体在任何温度下都在蒸发,蒸发是溶液表面的溶剂分子获得动能脱离液面逸向空间的过程。当溶液受热,液体中溶剂分子动能增加,蒸发过程加快。蒸发的快慢和温度、蒸发面积、液体表面积、液面蒸汽分子密度,即蒸汽压大小有关。各种液体在一定温度下都具有一定饱和蒸气压,当液面上的溶剂蒸气分子密度很小,经常处于不饱和的低压状态,液相与气相的溶剂分子为了维持其分子密度的动态平衡状态,溶液中的溶剂分子就必须不断地气化逸出空间,以维持其一定的饱和蒸气压力。因此,根据上述原理,蒸气浓缩装置常按照加热、扩大液体表面积、低压和加速空气流动等因素而设计的。

  2.冰冻法 冰冻法也是生物大分子及其他有机化合物浓缩的一种有效方法。生物大分子在冰冻时,水分结成冻,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融解点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液,用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液。

  吸收法  是一种通过吸收剂直接吸收溶液中的溶剂分子使溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶液不起化学反应,对生物大分子不起吸附作用,易与溶液分开,吸收剂除去溶剂后能重复使用。实验室中最常用的吸收剂有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝胶等。使用凝胶时,首先选择凝胶粒度大小恰好溶剂及低分子物质能渗入凝胶内,而生物大分子却完全排除于凝胶之外的,然后将洗净和干燥的凝胶直接投入待浓缩的稀溶液中,凝胶亲水性强,在水中溶胀时,溶剂及小分子被吸收到凝胶内,生物大分子留下剩余的溶液中,离心或过滤除去凝胶颗粒,即得已浓缩的生物大分子溶液。凝胶溶胀时吸收水分及小分子物质可同时起到浓缩及分离纯化两种作用,对生物大分子结构和生物活性都没有影响。是近年来生物化学及分子生物学日益广泛使用的浓缩和分离方法之一。

  使用聚乙二醇等其他吸收剂时,需先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,扎紧袋口,外加聚乙二醇复盖,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被溶剂饱和后,可更换新的,直到浓缩至所需的浓度为止。用完一次以后的聚乙二醇经过加热除去溶剂便可再次使用。

  4.超滤法 超滤法是使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。当溶液在一定压力下(外源氮气压或真空泵压)通过膜时,溶液和小分子透过,大分子受阻保留于原来溶液中,其原理如图2—2所示。这一近年发展起来的新方法是适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持生物大分子生理活性、回收率高等优点。除去浓缩、脱盐外,并可应用生物大分子的分离纯化,是目前民展较快且为人们所采用的生化技术之一。

图2-2 超滤法示意图

  通过超滤法,蛋白质和酶的稀溶液一般可浓缩到10%~15%浓度,回收率高达90%。超滤法应用关键在于膜选择。不同类型的规格的膜、水的流速(在规定压力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量数值)等参数均不同,必须根据工作的需要来选用。此外,超滤装置形式、溶质成分及性质、溶液浓度及粘度都对超滤的效果有一定影响。

  制品浓缩到一定程度,即可贮存,如有必要可采用低温干燥(冰干)的方法除去制品中溶剂,使之成干粉。

  制品的贮存可分干态贮存和液状贮存。但不论是何种方法贮存,都要避免长期暴露在空气中,防止微生物的污染。温度对生物活性物质的活性影响很大,在绝大多数情况下应采取低温保存。

  干态储藏:干燥的制品一般比较稳定,如制品含水量很低,在低温情况下,生物大分子活性可在数个月甚至数年没有显著变化。储藏方法也很简单,只将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封,保持0~4℃冰箱中即可。有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染,可先将样品分装成许多小瓶中,每次用时,只取一小瓶。

  液态储藏:液态储藏的优点是使样品减去干燥这一步骤,生物大分子的生理活性和结构破坏较少,缺点是需要较严格的防腐措施,储藏时间不能太长。如样品量大时封装运输不方便,实验室常采取少量安瓿封存方法。液态储藏注意事项如下:

  样品不能太稀,必须浓缩至一定浓度后才能封装储藏,样品太稀时容易引起生物大分子变性作用。

  一般需加入防腐剂和稳定剂,常用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和酶常用的稳定剂有蔗糖、甘油等,如酶也加入底物和辅酶以提高其稳定性,此外钙、锌、硼酸等盐溶液对某些酶也具有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸与氯化钠的标准缓冲液中。

  储藏温度要求较低,大多数在0℃左右冰箱保存即可,有的则要求更低温度。但注意某些具有活性的大分子如DNA溶液低温保存时,有宜使溶液结冰以造成其分子结构被破坏,另也有文献报道某些蛋白质和酶在低温中反而引起变性。故应分别情况对待,不能一概而论。

  生物大分子和各种生化制品的储藏和保存,总的来说,温度和水分是影响稳定性的两个重要因素,其次是各种稳定剂的应用是否适当关系也很大。实际应用时,必须对各方面都加以考虑。

  所提取、纯化的抗原物质,在使用前应进行定量测定。定量测定的方法,可根据不同的物质,选择合适的方法进行。

  某些分子量较小的抗原,如肽类半抗原,由于其结构较为简单,目前已有化学合成的纯品供应,不必自己去从组织中提取。化学合成是一项专门技术,可参阅有关书籍。

  二、免疫原的制备

  用为免疫动物产生抗体的抗原物质如果是人工合成的。质地比较纯,免疫动物后可获得质量好的抗血清。如果以从组织中提取的物质作为抗原,必须经过纯化,保证提取物的纯净,才能获得质量好的抗血清。某些物质的分子量比较小,抗原性弱,属于半抗原,不易使动物产生抗体,必须把这些半抗原连接到大分子物质(载体)上,形成较为理想的免疫原,既能减少免疫注射的次数,又可节约抗原,产生良好的免疫效应,获得高质量的抗体。

  (一)载体

  用为作为载体的物质较多,下列几类可供选择。

  蛋白质类载体:人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、牛甲状腺球蛋白(TG)、血蓝蛋白(Hemocyanin)以及人、牛和鸡γ-球蛋白等均可作为载体。这些载体免疫活性较强,有商品供应,容易获得,即使自选提取,操作也较方便。常用 的有TG、BSA、HAS等,以TG为好。

  多肽聚合物,人工合成的多聚赖氨酸 、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等,可与半抗原结合,所形成的免疫原可获高滴度、高亲合度的抗血清。

  大分子有机化合物和某些粉末,如聚乙烯吡咯酮、羧甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒、乳胶和炭末等,可吸附半抗原,也可用来作为载体,但用这类载体合成的免疫原免疫动物,所获抗血清的质量不稳定。

  载体,尤其是大分子物质本身就是一种抗原,它们进行体内,可发挥致敏作用,激活免疫系统,从而使半抗原也可以使机体产生优质的抗体。因此,如果把半抗原与无免疫原性的载体结合,就不能使机体产生抗体。另外,半抗原与载体结合后,可适当延迟其降解和排出体外,从而可以发挥更久的作用。

  (二)偶联剂

  半抗原和载体联接,操作比较简单,在一般实验室中都可进行。但对反应条件有一定的要求:在反应过程中半抗原的免疫活性不发生改变,也不应引起载体变性到不溶解的程度。常用的方法是利用偶联剂把半抗原和载体联接起来。用作偶联剂的有碳化二亚胺类、戊二醛、二异氰酸化合物和二卤化二硝基苯等。这些偶联剂使半抗原与载体在-COOH、-NH2或-SH等基团部位发生结合。

  碳化二亚胺偶联过程示意如下:

  由反应过程可见,碳化二亚胺的偶联作用即可以在NH2部位发生,也可发生在羧基部位。

  戊二醛所起的偶合作用与碳化二亚胺有所不同,戊二醛的两个醛基分别与载体和半抗原的-NH2结合。它起一种“桥梁”作用,而把载体与半抗原联接在一起,其反应过程为:

  在免疫原的制备中,应根据不同的半抗原选用偶联剂。

  (三)制备过程

  以制备催产素(OT)免疫原为例:

  (1)1mgOT,溶解于1ml 双蒸馏水或0.25%醋酸溶液中。10mgTG溶解于1ml 0.1mol/LPBS(pH7.5)或蒸馏水内。

  (2)把OT溶液与TG溶液振荡混匀。

  (3)边搅拌边滴加入0.25%戊二醛1ml。加毕后再搅拌5~10min,在室温下继续反应2~3h,就可供免疫动物用。

  免疫原以新制备的为好,如果一次制备了较多的免疫原,也可保存在-40℃的低温冰箱内备用。


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