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关于人凝血酶原复合物等4种制品规程转正的通知

来源:国家食品药品监督管理局 作者:国食药监注[2004]122号 2006-8-29
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摘要: 附件:1.人凝血酶原复合物制造及检定规程2.组织胺人免疫球蛋白制造及检定规程3.注射用抗乙型肝炎转移因子制造及检定规程4.金葡素注射液制造及检定规程国家食品药品监督管理局二○○四年四月十九日附件1:人凝血酶原复合物制造及检定规程RequirementsforProthrombinComplex本品系由健康人的血浆,经低温乙醇蛋白分离法......


各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局(药品监督管理局):

  原国家药品监督管理局曾于2000年8月4日印发《关于颁布执行〈中国生物制品规程〉2000年版的通知》(国药管注〔2000〕337号)规定,收载于《中国生物制品规程》2000年版暂行规程的品种,须在三年内(至2003年9月30日)完成相应的质量控制标准、检定方法及临床疗效的评价等工作。截止2003年9月30日,原收载于暂行规程的人凝血酶原复合物、组织胺人免疫球蛋白、注射用抗乙型肝炎转移因子和金葡素注射液等4个品种已完成了相关的改进工作,经中国生物制品标准化委员会相关专业委员会讨论通过,现予颁布(见附件),并就有关规程转正通知如下:

  一、上述4个品种转正规程自2004年8月1日起正式执行。自执行之日起,原暂行规程予以废止。

  二、生产上述暂行规程转正品种的药品生产企业应按照转正规程的要求,生产3批样品送中国药品生物制品检定所进行质量复核,并按照《药品注册管理办法(试行)》的相关规定拟定注册标准,以补充申请方式报我局审批。

  三、请各省、自治区、直辖市食品药品监督管理部门负责通知辖区内相关药品生产企业。

  四、对暂行规程中尚未获得批准转正的其他品种的处理意见,我局将另行通知。


  附件:1.人凝血酶原复合物制造及检定规程
     2.组织胺人免疫球蛋白制造及检定规程
     3.注射用抗乙型肝炎转移因子制造及检定规程
     4.金葡素注射液制造及检定规程


                          国家食品药品监督管理局
                          二○○四年四月十九日


附件1:

            人凝血酶原复合物制造及检定规程
           RequirementsforProthrombinComplex


  本品系由健康人的血浆,经低温乙醇蛋白分离法或经国家药品监督管理部门批准的其他方法提制,并经病毒灭活处理而得的冻干制剂,内含凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及适宜稳定剂。不含防腐剂和抗生素。

  1 基本要求
  1.1.1 设施与生产质量管理
  按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。厂房设施必须专用,不得与其他异种蛋白制剂混用。

  1.1.2 原料及辅料
  生产中所用的稀释剂、稳定剂、防腐剂、灭活剂、佐剂,及其他化工原料,其质量应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。
  辅料品种与用量应当无害,不影响制品的安全性和有效性,并应对规定的检定方法无干扰。
  化工及食品原料作为原料时,必须制定符合药用要求的标准,并需经国家药品监督管理部门批准。

  1.1.3 生产用水
  生产用水源水应符合饮用水标准,纯化水、注射用水及灭菌注射用水应符合现行《中国药典》标准。

  1.1.4 生产用器具
  直接用于生产的金属或玻璃等器具,必须专用,并经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。

  2 制造
  2.1 原料血浆
  2.1.1 血浆的来源、采集及质量应符合本版规程通则《原料血浆采集规程》要求。血浆应无凝块,无纤维蛋白析出,非脂血,无溶血。
  2.1.2 去除冷沉淀、凝血因子Ⅷ的血浆及组分Ⅲ沉淀均可用于生产。
  2.1.3 组分Ⅲ沉淀存放于-30℃以下,保存时间不得超过6个月。

  2.2 原液制备
  2.2.1 可采用直接从血浆中用凝胶吸附法或低温乙醇和聚乙二醇分离蛋白并经凝胶吸附法制备,亦可用经国家药品监督管理部门批准的其他方法制备。生产过程中不能加任何防腐剂或抗生素。
  2.2.2 蛋白质透析和浓缩,应采用超滤法。澄清及除菌过滤,应使用无石棉的介质。
  2.2.3 原液检定
  按3.1项进行。

  2.3 半成品制备
  2.3.1 配制
  按出品规格配制,制品内可加适宜的稳定剂。若加肝素,则每1.0IU因子Ⅸ肝素加量不超过0.5IU。
  2.3.2 半成品检定
  按3.2项进行。

  2.4 成品制备
  2.4.1 分批
  应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。
  2.4.2 分装及冻干
  按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。除菌过滤分装的制品应立即冻结。冻干过程制品温度不得超过35℃,真空封口。
  2.4.3 规格
  每瓶人凝血因子Ⅸ的效价可分为100、200、300、400、1000IU5种,同时制品还含有人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ。
  2.4.4 包装
  应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。

  2.5 病毒去除和灭活
  生产过程中应有特定的去除和灭活脂包膜和非脂包膜病毒处理。如果应用灭活剂(如有机溶剂、去污剂)灭活病毒,则应规定人用安全的灭活剂残留量最高限值。

  3 检定
  3.1 原液检定
  3.1.1 pH值
  按3.3.3.2项进行。
  3.1.2 活性测定
  3.1.2.1 人凝血因子Ⅸ活性及比活性
  每1ml人凝血因子Ⅸ效价应不低于10IU(附录1),比活性应不低于0.3IU/mg蛋白。

  3.2 半成品检定
  3.2.1 热原质试验
  按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射30IU人凝血因子Ⅸ,应符合规定。
  3.2.2 无菌试验
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,符合规定。

  3.3 成品检定
  每批制品应抽样作全面质量检定,不同机柜冻干的制品分别抽样做无菌试验和水分测定。以下检定项目除真空度、溶解时间、水分外,其余项目按制品标示量加入灭菌注射用水溶解后进行检定。
  3.3.1 鉴别试验
  按《中国生物制品规程》2002年增补本《血液制品鉴别试验》A法进行。仅与抗人的血清产生沉淀线,与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线。
  3.3.2 物理检查
  3.3.2.1 外观
  应为白色或灰绿色疏松体,复溶后应为无色、淡黄色、淡蓝色或黄绿色澄明溶液,不应有异物或沉淀。
  3.3.2.2 真空度
  以高频火花真空测定器检测,瓶内应出现蓝紫色辉光。
  3.3.2.3 溶解时间
  向已平衡至20~25℃的制品,加入标示量的20~25℃灭菌注射用水,轻轻摇动,应于15分钟内完全溶解。
  3.3.3 化学检定
  按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
  3.3.3.1 水分
  应不高于3.0%。
  3.3.3.2 pH值
  在20℃±2℃测定,pH值为6.5~7.5。
  3.3.3.3 PEG含量
  应不高于0.5g/L。
  3.3.3.4 钠离子含量
  应不高于160mmol/L。
  3.3.3.5 枸橼酸离子含量
  应不高于25mmol/L。
  3.3.4 效价测定
  3.3.4.1 人凝血因子Ⅸ
  3.3.4.1.1 效价
  按附录1法测定,凝血因子Ⅸ活性应不低于10IU。按3.3.2.3项加入的溶剂量,计算每瓶人凝血因子Ⅸ效价,应为标示量的80%~140%。
  3.3.4.1.2 比活性
  应不低于0.3IU/mg蛋白质。
  3.3.4.2 人凝血因子Ⅱ效价
  按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅱ活性(附录2),计算每瓶人凝血因子Ⅱ效价,应不低于标示量的80%。
  3.3.4.3 人凝血因子Ⅶ效价
  按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅶ活性(附录3),计算每瓶人凝血因子Ⅶ效价,应不低于标示量的80%。
  3.3.4.4 人凝血因子Ⅹ效价
  按3.3.2.3项加入的溶剂量及每1ml人凝血因子Ⅹ活性(附录4),计算每瓶人凝血因子Ⅹ效价,应不低于标示量的80%。
  3.3.5 人凝血酶活性
  按附录5方法测定。不得有凝块或纤维蛋白析出。
  3.3.6 肝素含量
  按附录6法测定,每1IU人凝血因子Ⅸ肝素含量应不高于0.5IU。
  3.3.7 活化的凝血因子
  按附录7方法测定,凝固时间应不低于150秒。
  3.3.8无菌检查
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,符合规定。
  3.3.9 异常毒性检查
  按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。豚鼠每只注射供试品5ml(每1ml含10IU人凝血因子Ⅸ),小鼠每只注射供试品0.5ml(每1ml含10IU人凝血因子Ⅸ),应符合规定。
  3.3.10 热原质检查
  按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射30IU人凝血因子Ⅸ,应符合规定。
  3.3.11 HBsAg
  按试剂盒说明书测定,应为阴性。
  3.3.12 根据病毒灭活方法,应增加相应的检定项目。若采用磷酸三丁酯和吐温-80法灭活病毒,则应检测磷酸三丁酯和吐温-80残留量。
  3.3.12.1 磷酸三丁酯残留量
  应不高于10μg/ml。
  3.3.12.2 吐温-80残留量
  应不高于100μg/ml。

  4 保存、运输及有效期
  应在2~8℃避光保存和运输。有效期自分装之日起,按国家药品监督管理部门批准的执行。

  5 使用说明
  根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。

  6 附录
  附录1 人凝血因子Ⅸ效价测定法(一期法)
  附录2 人凝血因子Ⅱ效价测定法(一期法)
  附录3 人凝血因子Ⅶ活性测定法(一期法)
  附录4 人凝血因子X效价测定法(一期法)
  附录5 人凝血酶活性测定法
  附录6 肝素含量测定法(凝固法)
  附录7 活化的凝血因子活性测定法


          附录1 人凝血因子Ⅸ效价测定法(一期法)

  本法用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆作为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅸ效价。

  1 试剂
  1.1 3.8%柠檬酸三钠溶液
  称取无水柠檬酸三钠9.5g,加水溶解并稀释至250ml。
  1.2 咪唑缓冲液
  称咪唑0.68g和氯化钠1.17g溶于100ml水中,加入0.1mol/L盐酸42.2ml,然后补加水至200ml,pH为7.3。
  1.3 稀释液
  取1容积的3.8%柠檬酸三钠加入5容积咪唑缓冲液混合,加人血白蛋白至终浓度为1%。
  1.4 激活的部分凝血活酶(APTT)试剂
  1.5 人凝血因子Ⅸ缺乏血浆
  为人凝血因子Ⅸ含量低于1%的乙型血友病病人血浆或人工基质血浆。
  1.6 0.05mol/L氯化钙溶液
  称氯化钙(CaCl2.2H2O)147g,加水溶解并稀释至1000ml,配制成1mol/L氯化钙贮存液,用前用水稀释20倍,配成0.05mol/L氯化钙溶液。

  2 人凝血因子Ⅸ标准溶液的配制
  用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将人凝血因子Ⅸ标准品稀释成1IU/ml,再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴待用。

  3 供试品溶液的配制
  若供试品中含有肝素,先用硫酸鱼精蛋白中和供试品中的肝素。测定时先用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释成约1IU/ml,再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

  4 测定法
  取APTT试剂0.1ml,置37℃保温一定时间(一般4分钟),加人凝血因子Ⅸ缺乏血浆0.1ml、供试品溶液0.1ml,混匀,置37℃保温一定时间(一般5分钟),加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。
  用不同稀释度的人凝血因子Ⅸ标准溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

  5 结果计算
  将标准溶液中人凝血因子Ⅸ活性(IU/ml)对其相应的凝固时间(秒)进行双对数直线回归处理,求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间(秒)对数值代入方程,求得的值的反对数,再乘以稀释倍数,即为每1ml供试品溶液中人凝血因子Ⅸ效价(IU/ml),取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅸ效价均值即为供试品中人凝血因子Ⅸ效价(IU/ml)。


  【附注】
  (1)直线回归相关系数应不低于0.98。
  (2)测定时,要求每个稀释度平行测定2管,两管之差不得超过均值10%,否则重测。
  (3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。
  (4)标准品和供试品稀释后,应置冰浴待用。
  (5)采用全自动凝血仪时,则按仪器使用说明书进行。


           附录2 人凝血因子Ⅱ效价测定法(一期法)

  本法用人凝血因子II缺乏血浆作为基质血浆,采用一期法测定供试品中人凝血因子II效价。

  1 试剂
  1.1 稀释液
  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中,用1mol/L盐酸调pH至7.3,再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。
  1.2 含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
  1.3 人凝血因子II缺乏血浆
  人凝血因子II含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。

  2 人凝血因子Ⅱ标准溶液的配制
  用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将人凝血因子Ⅱ标准品稀释成1IU/ml,再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

  3 供试品溶液的配制
  用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml,再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

  4 测定法
  取供试品溶液0.1ml,加人凝血因子Ⅱ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴保温一定时间(一般3分钟),然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅱ标准溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

  5 结果计算
  将标准溶液人凝血因子Ⅱ活性(IU/ml)对其相应的凝固时间(秒)进行双对数直线回归处理,求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间(秒)对数值代入方程,求得的值的反对数,即为供试品人凝血因子Ⅱ效价,再乘以稀释倍数,即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅱ效价(IU/ml),取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅱ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅱ效价(IU/ml)。


  【附注】
  (1)直线回归相关系数应不低于0.98。
  (2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,两管之差不得超过均值10%,否则重测。
  (3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。
  (4)标准品和供试品稀释后,应置冰浴待用。
  (5)采用全自动凝血仪时,则按仪器使用说明书进行。


          附录3 人凝血因子Ⅶ效价测定法(一期法)

  本法用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆作为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅶ效价。

  1 试剂
  1.1 稀释液
  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中,用1mol/L盐酸调pH至7.3,再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。
  1.2 含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
  1.3 人凝血因子Ⅶ缺乏血浆
  人凝血因子Ⅶ含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。
  人凝血因子Ⅶ标准溶液的配制
  用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将人凝血因子Ⅶ标准品稀释成1IU/ml,再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

  2 供试品溶液的配制
  用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml,再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

  3 测定法
  取供试品溶液0.1ml,加人凝血因子Ⅶ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴保温一定时间(一般3分钟),然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅶ标准溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

  4 结果计算
  将标准溶液人凝血因子Ⅶ效价(IU/ml)对其相应的凝固时间(秒)进行双对数直线回归处理,求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间(秒)对数值代入方程,求得的值的反对数,再乘以稀释倍数,即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅶ效价(IU/ml),取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅶ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅶ效价(IU/ml)。


  【附注】
  (1)直线回归相关系数应不低于0.98。
  (2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,两管之差不得超过均值10%,否则重测。
  (3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。
  (4)标准品和供试品稀释后,应置冰浴待用。
  (5)采用全自动凝血仪时,则按仪器使用说明书进行。


          附录4 人凝血因子X效价测定法(一期法)

  本法用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆作为基质血浆,采用一期法测定供试品人凝血因子Ⅹ效价。
  1 试剂
  1.1 稀释液
  称取巴比妥钠11.75g、氯化钠14.67g溶于1570ml水中,用1mol/L盐酸调pH至7.3,再加水至2000ml。用前加人血白蛋白至终浓度为1%。
  1.2 含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
  1.3 人凝血因子Ⅹ缺乏血浆
  人凝血因子Ⅹ含量低于1%的病人血浆或人工基质血浆。
  2 人凝血因子Ⅹ标准溶液的配制
  用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将人凝血因子Ⅹ标准品稀释成1IU/ml,再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释,置冰浴备用。

  3 供试品溶液的配制
  用人凝血因子Ⅹ缺乏血浆将供试品稀释成约1IU/ml,再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释,置冰浴待用。

  4 测定法
  取供试品溶液0.1ml,加人凝血因子Ⅹ缺乏血浆0.1ml,混匀,置37℃水浴保温一定时间(一般3分钟),然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml,记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅹ标准溶液0.1ml替代供试品溶液,同法操作。

 5 结果计算
  将标准溶液人凝血因子Ⅹ效价(IU/ml)对其相应的凝固时间(秒)进行双对数直线回归处理,求出直线回归方程。将供试品溶液的凝固时间(秒)对数值代入方程,求得的值的反对数,再乘以稀释倍数,即为每1ml供试品溶液人凝血因子Ⅹ效价(IU/ml),取供试品各稀释度的人凝血因子Ⅹ效价均值即为供试品人凝血因子Ⅹ效价(IU/ml)。


  【附注】
  (1)直线回归相关系数应不低于0.98。
  (2)测定时要求每个稀释度平行测定2管,两管之差不得超过均值10%,否则重测。
  (3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料或硅化制品。
  (4)标准品和供试品稀释后,应置冰浴待用。
  (5)采用全自动凝血仪时,则按仪器使用说明书进行。


             附录5 人凝血酶活性测定法

  本法依据凝血酶能使人纤维蛋白原凝固原理,将供试品和人纤维蛋白原混合,观察是否产生凝块,根据凝块判定制品是否含有凝血酶活性。

  1 试剂
  1.1 5g/L纤维蛋白原溶液
  用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人纤维蛋白原稀释成5g/L。
  1.2 生理氯化钠溶液
  1.3 硫酸鱼精蛋白
  1.4 人凝血酶
  用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人凝血酶稀释成0.5IU/ml。

  2 测定法
  取供试品0.2ml,加5g/L纤维蛋白原溶液0.2ml,37℃放置24小时,观察有无凝块或纤维蛋白析出。放置期间至少观察2次。本试验同时做阴性及阳性对照。
  阴性对照:用0.2ml生理氯化钠溶液替代供试品,其余操作同供试品。
  阳性对照:用0.2ml0.5IU/ml凝血酶替代供试品,其余操作同供试品。

  3 结果判定
  阴性对照无任何凝块或纤维蛋白析出,阳性对照有凝块或纤维蛋白析出,则试验成立。肉眼观察供试品有无凝块或纤维蛋白析出。

  【附注】
  含肝素的供试品应根据肝素含量,用适量的硫酸鱼精蛋白中和供试品内的肝素,再取供试品检查(按10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素进行)。


           附录6 肝素含量测定法(凝固法)

  本法依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素,从而影响血浆凝固时间的原理,测定供试品中肝素含量。

  1 试剂
  1.1 缺血小板人血浆
  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂中(9∶1),混匀,4℃、1500r/min离心30分钟,用塑料注射器取上层2/3的血浆,4℃、3500r/min离心30分钟,取上层2/3血浆,分装于塑料管中,每支3ml,保存-40℃备用。
  1.2 pH7.5Tris缓冲液
  称取Tris7.27g、氯化钠5.27g,加水溶解并稀释至1000ml(用HCl调pH至7.5)。
  1.3 脑磷脂混悬液
  冻干脑磷脂加水复溶,用生理氯化钠溶液稀释,稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时在200~300秒。
  1.4 0.025mol/L氯化钙溶液
  称取147g氯化钙(CaCl2.2H2O)溶于1000ml水中,配成1mol/L氯化钙贮存液,用时用水稀释40倍,配成0.025mol/L氯化钙溶液。
  1.5 硫酸鱼精蛋白溶液
  称取适量硫酸鱼精蛋白,用pH7.5Tris缓冲液溶解并稀释成1~20mg/ml浓度。
  供试品溶液的配制
  于每支含10μl不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液的塑料管中,各加按标示量复溶后的供试品0.5ml,混匀。

  2 测定法
  向已含有缺血小板人血浆0.1ml的塑料管中、加脑磷脂混悬液0.1ml,混匀,37℃、1分钟,加供试品溶液0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。用0.1mlTris缓冲液(pH7.5)代替混合物,同法操作作空白对照。

  3 结果计算
  空白对照凝固时间不低于200秒试验成立。取凝固时间最短的供试品管,作为硫酸鱼精蛋白中和0.5ml供试品中的肝素量。10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素。例如混合物中每1ml含30μg硫酸鱼精蛋白,中和0.5ml供试品中的肝素量则为3IU,即每1ml供试品含6IU肝素。


  【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料或硅化的玻璃制品。


            附录7 活化的凝血因子活性测定法

  本法依据活化的凝血因子活性在脑磷脂存在的情况下使缺血小板人血浆发生凝固的原理,将供试品和人缺血小板血浆及脑磷脂混合,测定凝固时间,根据凝固时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。

  1 试剂
  1.1 缺血小板人血浆
  无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂中(9∶1),混匀,4℃、1500r/min离心30分钟,用塑料注射器取上层2/3的血浆,4℃、3500r/min离心30分钟,取上层2/3血浆,分装于塑料管中,每支3ml,保存-40℃备用。
  1.2 pH7.5Tris缓冲液
  称取Tris7.27g、氯化钠5.27g,加水溶解并稀释至1000ml(用HCl调pH至7.5)。
  1.3 脑磷脂混悬液
  冻干脑磷脂加水复溶,用生理氯化钠溶液稀释,稀释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时在200~300秒。
  1.4 0.025mol/L氯化钙溶液
  称取147g氯化钙(CaCl2.2H2O)溶于1000ml水中,配制成1mol/L氯化钙贮存液,用时用水稀释40倍,配制成0.025mol/L氯化钙溶液。
  1.5 硫酸鱼精蛋白溶液
  称取适量硫酸鱼精蛋白,用pH7.5Tris缓冲液溶解并稀释成适宜浓度。

  2 供试品溶液的配制
  取复溶后的供试品,根据测定的肝素含量加入适量硫酸鱼精蛋白中和供试品中的肝素(10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素),再用Tris缓冲液(pH7.5)做稀释10和100倍。

  3 测定法
  取缺血小板人血浆0.1ml,加脑磷脂混悬液0.1ml,混匀,37℃、1分钟,加供试品溶液(10倍或100倍稀释液)0.1ml、已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml,记录凝固时间。用0.1mlTris缓冲液(pH7.5)替换供试品溶液,同法操作作空白对照。

  4 结果判定
  空白对照凝固时间不低于200秒试验成立。1:10和1:100供试品稀释液凝固时间均应不低于150秒。


  【附注】
  (1)直接与血和血浆接触的器具应为塑料或硅化的玻璃制品。从供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。
  (2)供试品每个稀释度作2管。〖LM〗


附件2:

            组织胺人免疫球蛋白制造及检定规程
             RequirementsforHumanHistaglobulin

  本品系由人免疫球蛋白、磷酸组织胺(或盐酸组织胺)配制而成的冻干制剂,能刺激机体产生抗组织胺的抗体,从而消除内源性组织胺的致病作用。本品不含抗生素。

  1 基本要求
  1.1.1 设施与生产质量管理
  按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。厂房设施必须专用,不得与其他异种蛋白制剂混用。
  1.1.2 原料及辅料
  生产中所用的稀释剂、稳定剂、防腐剂、灭活剂、佐剂,及其他化工原料,其质量应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。
  辅料品种与用量应当无害,不影响制品的安全性和有效性,并应对规定的检定方法无干扰。化工及食品原料作为原料时,必须制定符合药用要求的标准,并需经国家药品监督管理部门批准。
  1.1.3 生产用水
  生产用水源水应符合饮用水标准,纯化水、注射用水及灭菌注射用水应符合现行《中国药典》标准。
  1.1.4 生产用器具
  直接用于生产的金属或玻璃等器具,必须专用,并经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。

  2 制造
  2.1 主要原料
  人免疫球蛋白应符合现行版规程中《人免疫球蛋白制造及检定规程》要求。
  2.2 半成品制备
  2.2.1 配制
  按每1ml含磷酸组织胺(或盐酸组织胺)0.075~0.25μg,人免疫球蛋白6mg,硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)8~30mg配制而成,冻干制剂可加入葡萄糖5mg。
  2.2.2 配制好的原液应立即进行除菌过滤。除菌过滤前应调pH为6.6~7.4。澄清及除菌过滤,应使用无石棉的介质。
  2.2.3 半成品检定
  按3.1项进行。
  2.3 成品制备
  2.3.1 分批
  应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。
  2.3.2 分装及冻干
  按本版规程通则《生物制品分装规程》进行.除菌过滤分装的制品应及时冻结。冻干过程制品温度不得超过35℃,真空封口。
  2.3.3 规格
  每支(瓶)人免疫球蛋白装量应不低于12mg。
  2.3.4 包装
  应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。

  3 检定
  3.1 半成品检定
  3.1.1 蛋白质含量
  应不低于6g/L。
  3.1.3 pH值
  按3.3.3.2项进行。
  3.1.4 无菌检查
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.1.5 热原质检查
  按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射3ml,应符合规定。
  3.3 成品检定
  每批成品应抽样作全面检定。不同机柜冻干制品应分别抽样作无菌检查及水分测定。冻干制剂,以下检定项目除真空度、溶解时间、水分外,其余项目按制品标示量加入灭菌注射用水溶解后进行检定。
  3.3.1 鉴别试验
  按《中国生物制品规程》2002年增补本《血液制品鉴别试验》B法进行,主要沉淀线应为人免疫球蛋白。
  3.3.2 物理检查
  3.3.2.1 外观
  应为白色或淡黄色疏松体,无融化迹象。冻干制剂复溶后应为无色或淡黄色溶液,可带乳光,不应有异物、混浊或摇不散的沉淀。
  3.3.2.2 溶解时间
  冻干制剂加灭菌注射用水2ml,应在10分钟内溶解。
  3.3.3 化学检定
  按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。
  3.3.3.1 水分
  取供试品0.2~1.0g置于已干燥至恒重的称量瓶中,加盖,精密称定重量(称量瓶中供试品厚度应在5mm以下),放入五氧化二磷干燥器中,打开瓶盖,于60℃将干燥器抽真空至133Pa以下,干燥至恒重。干燥完毕应缓慢通入经浓硫酸脱水的干燥空气。按下式计算供试品水分含量,应不高于5.0%。
  供试品水分含量%(W/W)=干燥失重÷供试品重量×100
  3.3.3.2 pH值
  应为6.0~8.0。
  3.3.3.3 蛋白质总量
  按3.3.2.2项加入的溶剂量,再乘以供试品蛋白质量含量(g/ml),计算每瓶蛋白质总量,应不低于12mg。
  3.3.3.4 游离磷酸组胺含量
  按附录1方法测定,应不大于0.2μg/ml。
  3.3.3.5 磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率
  按下式计算磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率,应不低于30%。
                     W(μg/ml)-F(μg/ml)
  磷酸组胺与人免疫球蛋白结合率(%)= ─────────────×100
                        W(μg/ml)
   式中:W为加入的磷酸组胺量;F为游离磷酸组胺含量
  3.3.3.6 糖含量
  若制品中加糖(葡萄糖、麦芽糖等),其含量应不高于50g/L。
  3.3.3.7 硫柳汞含量
  若制品中加硫柳汞,其含量应不高于0.1g/L。
  3.3.4 无菌检查
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,符合规定。
  3.3.5 异常毒性检查
  按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行,符合规定。
  3.3.6 热原质检查
  按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。注射剂量按家兔体重每1kg注射3ml,应符合规定。

  4 保存、运输及有效期
  在2~8℃避光保存和运输。有效期自分装之日起,按国家药品监督管理部门批准的执行。

  5 使用说明
  根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。

  6 附录
  组织胺人免疫球蛋白磷酸组胺测定方法


         附录  组织胺人免疫球蛋白磷酸组胺测定方法

  该法通过磷酸组织胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物,测定组织胺人免疫球蛋白制品中游离磷酸组胺含量。

  1 试剂
  1.1 100ng/ml磷酸组织胺标准工作液
  精密称取磷酸组织胺标准品2.76mg,加0.1mol/L盐酸溶解并稀释至10.0ml,摇匀,配置成100μg/ml贮备液,-20℃贮存备用。试验当天取贮备液0.1ml,用0.1mol/L盐酸定溶至100ml,即为100ng/ml磷酸组织胺标准工作液。
  1.2 25%三氯乙酸溶液
  称取三氯乙酸25g,加水溶解并稀释至100ml。
  1.3 0.1%邻苯二甲醛-甲醇溶液
  称取邻苯二甲醛0.1g,加甲醇溶解并稀释至100ml。
  1.4 0.5mol/L盐酸溶液
  取浓盐酸4.17ml,加甲醛至100ml。
  1.5 0.1mol/L盐酸溶液
  取0.5mol/L盐酸20ml,加水至100ml。
  1.6 2.5mol/L氢氧化钠溶液
  称取氢氧化钠10g,加水100ml溶解。
  1.7 0.4mol/L氢氧化钠溶液
  取2.5mol/L氢氧化钠16ml,加水至100ml。

  2 供试品溶液的配制
  取供试品0.5ml,加水1.2ml,混匀,加25%三氯乙酸0.3ml混匀,4000r/min离心10分钟后取上清液备用。

  3 测定法
  取供试品溶液1.6ml置于已加1.5gNaCl的试管中,加正丁醇4.0ml、2.5mol/L氢氧化钠溶液0.2ml,立即混匀5分钟,静置后,取出3.6ml正丁醇相,加到已装有1.2ml的0.1mol/L盐酸溶液和2.0ml正庚烷的试管内,震荡5分钟,弃有机相,取出1.0ml盐酸相加入等体积水,再加0.4mol/L氢氧化钠溶液0.5ml,混匀并迅速加入0.1%邻苯二甲醛甲醇液0.1ml,立即混匀,置21~22℃、10分钟,加0.5mol/L盐酸0.5ml终止反应。取96孔酶标板,每孔加入上述经盐酸终止反应的溶液200μl,用荧光酶标仪,在激发波长350nm和荧光波长450nm下测吸光度。
  精密量取100ng/ml磷酸组织胺标准工作液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml和0.025ml,并以0.1mol/L盐酸溶液补足至1.0ml;向各管中加水0.5ml和25%三氯乙酸溶液0.1ml混匀,以后操作同供试品。

  4 结果计算
  将标准液磷酸组织胺含量对其相应的吸光度做直线回归,求得直线回归方程。将供试品吸光度代入直线回归方程求出供试品溶液碱基含量(G),按下式计算供试品游离组胺含量。

  供试品游离组胺含量(ng/ml)=G×2.76×2.5(稀释倍数)


  【附注】 磷酸组胺分子量为307.148,标准液浓度按碱基计,碱基与磷酸组胺分子量比为1:2.763。


附件3:

          注射用抗乙型肝炎转移因子制造及检定规程
         RequirementsforAnti-HBVTransferFactorforInjection


  本品用经乙型肝炎疫苗免疫的健康猪的脾脏和淋巴结,以冻融法破碎细胞,通过离心、超滤、巴氏消毒法等方法精制后制成的冻干制剂。

  1基本要求
  1.1设施与生产质量管理
  按中国《药品生产质量管理规范》的要求实施。
  1.2 原料及辅料
  应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求,未纳入上述标准的化学试剂,应不低于化学纯。
  1.3 生产用水
  生产用水源水应符合国家饮用水标准;纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
  1.4生产用器具
  直接用于生产的金属或玻璃等器具,应经过严格清洗、去热原质处理或灭菌处理。

  2 制造
  2.1 供体猪要求
  2.1.1 供体猪检疫
  供体猪应检测无猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒和乙型脑炎病毒污染。如系经疫苗免疫过的猪,应进行抗体检测,结果应为阳性。
  2.1.2 对脾脏、淋巴结的要求
  经乙型肝炎疫苗免疫后抽血检查HBsAg抗体滴度达1∶40以上或皮试阳性者可摘取脾脏或淋巴结,并在24小时内放入-30℃中保存。有炎症、化脓或坏死变质的脾脏或淋巴结不得使用。

  2.2 原液制备
  2.2.1 将新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25℃左右去脂肪及结缔组织,然后用纯化水洗净。
  2.2.2 细胞破碎
  将洗净的组织切成小块,加入适量注射用水,用组织捣碎机破碎细胞,制成匀浆,加适量注射用水,混匀,置-20℃反复冻融5~8次,融化温度不得超过37℃。
  2.2.3 离心分离
  将冻融的匀浆离心(离心温度4℃),去沉淀,留上清液备用。
  2.2.4 澄清过滤与超滤
  上清液用0.45μm的微孔滤膜进行过滤,然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。
  2.2.5 污染病毒的灭活或去除
  采用经国家药品监督管理部门批准的方法灭活或去除病毒,即为原液。冻存于-20℃或以下,保存期为2个月。

  2.3 原液检定
  按3.1项进行。

  2.4 半成品制备
  2.4.1 配制与除菌
  配制时加入适量甘露醇作为稳定剂,用0.22μm微孔滤膜除菌过滤,即为半成品。
  2.4.2 分批
  应符合本版规程通则《生物制品分批规程》的有关规定。

  2.5 半成品检定
  按3.2项进行。

  2.6成品制备
  2.6.1 分装及冻干
  应符合本版规程通则《生物制品分装规程》的有关规定。
  2.6.2规格
  每支含多肽2mg。
  2.6.3包装
  应符合本版规程通则《生物制品包装规程》的有关规定。

  3 检定
  3.1 原液检定
  3.1.1 无菌试验
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.1.2 pH值
  在20℃±2℃测定,pH值应为6.5~7.5。
  3.1.3 蛋白质反应
  取制品2ml,加20%磺基水杨酸2ml应呈阴性反应。
  3.1.4 细菌内毒素
  按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行。应小于10EU/支。
  3.1.5 多肽含量
  应不低于1.0mg/ml。
  3.1.6 核糖含量
  应不低于70μg/ml。
  3.1.7 特异活性试验
  方法见附录。未粘附细胞抑制指数(NAI)应不低于30%。

  3.2 半成品检定
  3.2.1细菌内毒素
  按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行,应小于10EU/支。
  3.2.2无菌检查
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.2.3 pH值
  在20℃±2℃测定,pH值应为6.5~7.5。

  3.3 成品检定
  除水分外,其余项目按制品标示量(2.0ml)加入灭菌注射用水溶解后进行检定。
  3.3.1 鉴别试验
  用SEC-HPLC法:色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂;流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05%叠氮钠,pH7.0;上样量20μl,用波长260nm检测,本品色谱峰应与对照品一致。
  3.3.2 外观
  应为白色或微黄色疏松体,加入灭菌注射用水后应迅速溶解为澄明液体,不得含有肉眼可见异物或摇不散沉淀。
  3.3.3 pH值
  在20℃±2℃测定,pH值应为6.5~7.5。
  3.3.4水分  
  应不高于3.0%(W/W)。
  3.3.5 多肽含量  
  应不低于1.0mg/ml。
  3.3.6 核糖含量
  应不低于70μg/ml。
  3.3.7 分子量及组分测定
  用SEC-HPLC法:色谱柱以适合分离多肽的色谱用凝胶为填充剂;流动相为0.1mol/LPB-0.1mol/L硫酸钠-0.05%叠氮钠,pH7.0;上样量20μl,用波长260nm检测,同时做低分子量标准多肽,不得检出分子量为10KD以上的组分。
  3.3.8 特异活性试验
  未粘附细胞抑制指数(NAI)应不低于30%。
  3.3.9 蛋白质反应
  取制品2ml加20%磺基水杨酸2ml,应呈阴性反应。
  3.3.10 无菌检查
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.3.11 细菌内毒素
  按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行,应小于10EU/支。
  3.3.12 异常毒性检查
  按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》中小鼠试验项进行。
  3.3.13 外源病毒污染检查
  用动物病毒敏感的细胞(如BHK21),盲传3代,结果应呈阴性。

  4 保存、运输及有效期
  于2~8℃避光保存和运输。自分装之日起有效期为2年。

  5 使用说明
  根据国家药品监督管理部门批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。

  6 附录
  抗乙型肝炎转移因子活性测定(白细胞粘附抑制试验)


           附录 抗乙型肝炎转移因子特异活性测定
                (白细胞粘附抑制试验)

  抗乙型肝炎转移因子能够抑制白细胞在玻璃器皿表面的粘附作用,根据未粘附白细胞数计算抑制指数来测定抗乙型肝炎转移因子活性。
  1 试剂
  1.1 RPMI1640培养液:称取2.2g碳酸氢钠、5.9gHEPES,加1000ml1640培养液使溶解。经0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
  1.2 3.6%氯化钠溶液:称取3.6g氯化钠,溶于100ml水,经121℃、15分钟高压灭菌。

  2 测定法
  2.1 小鼠白细胞悬液的制备
  取体重22~25g健康小鼠5只,由眼静脉放血,无菌取出脾脏,以1640培养液洗3次,用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液,用1640培养液洗3次(1500r/min离心15分钟),然后每只鼠脾脏加3ml水破坏红细胞,再加3.6%氯化钠溶液1ml调整渗透压,混匀后用200目尼龙网过滤,滤液经1500r/min离心5分钟,再分别用0.9%氯化钠溶液和1640培养液各洗1次,收集细胞,用1640培养液调整细胞浓度为1.0×106-3.0×106个/ml,备用。

  2.2 取供试品,按标示量加注射用水制成1mg/ml的溶液。取洁净的离心管2支,各加细胞悬液1ml,一管加供试品1ml,为供试品管;另一管加无菌0.9%氯化钠溶液1ml,为对照管。置37℃致敏30分钟,1500r/min离心10分钟,弃上清夜,每管沉淀分别准确加入1640培养液1ml。取无菌培养瓶6个,前3瓶各加供试品管细胞悬液0.2ml,后3瓶各加对照管细胞悬液0.2ml,然后每瓶内加纯化的30~100μg/mlHBsAg0.2ml,1640培养液0.6ml,置CO2培养箱内37℃培养1-2小时后,取出轻轻摇匀,静置1-3分钟,显微镜下计数未粘附的白细胞数。

  3 结果计算
  按下式计算结果:
  NAI=(S-C)/C×100%。
  式中:NAI未粘附白细胞抑制指数;
  S供试品组平均未粘附细胞数;
  C对照组平均未粘附细胞数。


附件4:

             金葡素注射液制造及检定规程
         RequirementsforStaphylococcalEnterotoxinCInjection


  本品系用金黄色葡萄球菌经培养除菌过滤制成的淡黄色或无色澄明液体。

  1 基本要求
  1.1 设施与生产质量管理
  按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。
  1.2 原料及辅料
  应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求,未纳入上述标准的化学试剂,应不低于化学纯。
  1.3 生产用水
  生产用水源水应符合国家饮用水标准;纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
  1.4 生产用器具
  直接用于生产的金属或玻璃等器具,应经过严格清洗、去热原质处理及灭菌处理。

  2 制造
  2.1 菌种
  2.1.1 菌种名称及来源
  金黄色葡萄球菌生产用菌株需经国家药品监督管理部门批准,并由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。
  2.1.2 种子批的建立
  生产用菌种应采用种子批系统,原始种子批应验明其记录、历史来源和生物学特性。从原始种子批传代、扩增后经冻干保存为主种子批;从主种子批传代、扩增后冻干保存为工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。
  2.1.3 种子批的检定
  主种子批和工作种子批应进行下列检定。
  2.1.3.1 形态特征
  革兰氏阳性球菌,直径0.5~1.0μm,成葡萄串状排列。
  2.1.3.2 培养特性
  在血琼脂或其它适宜培养基的平板培养基上,35℃培养18~36小时,长成直径1.0~2.0mm圆形隆起,表面光滑湿润,边缘整齐的金黄色菌落,菌落周围有大而透明的溶血环;肉汤培养物呈混浊生长,底部有沉淀。
  2.1.3.3  生化反应
  在糖类发酵培养基中生长18~24小时后,发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖,产酸不产气,不发酵阿拉伯糖和木糖,能产生血浆凝固酶。
  2.1.3.4 血清学凝集试验
  用抗血清作定量凝集试验,其凝集效价应不低于血清原效价之半。
  2.1.3.5 毒力试验
  肉汤培养物用生理氯化钠溶液稀释成5个不同浓度稀释液,每个浓度用体重18~20g小鼠5只,每只腹腔注射1.0ml,观察3天,记录小鼠死亡情况,计算LD50,1个LD50的菌数应小于1.5×109。
  2.1.3.6 抗原性试验
  选体重2.0~2.5Kg健康家兔3只,先腹腔注射3次,然后静脉注射3次,每次注射剂量分别为含菌1.0×1010/ml不含防腐剂的死菌悬液(可用0.6%福尔马林37℃作用7天杀菌兼脱毒;或加热杀菌)1、2、4、6、8、10ml,每次间隔3天,末次注射后12天采血做定量凝集试验,2/3家兔血清之凝集效价应达1∶800(+)。

  2.2 原液制备
  2.2.1 生产用种子
  工作种子批菌种启开后,转种肉汤,35℃培养18~36小时,经菌形、纯度检查合格后,作为生产用种子液。
  2.2.2培养基
  采用经国家药品监督管理部门批准的培养基。
  2.2.3 培养
  用18~36小时生长良好的种子液,接种于生产用培养基中,35℃培养20~24小时。
  2.2.4 纯菌检查
  取生长对数期后期每瓶或罐培养物,涂片革兰氏染色镜检;接种血琼脂平板,35℃18~24小时培养。有杂菌生长者废弃。
  2.2.5 培养液合并
  经纯菌检查合格的培养液进行合并。
  2.2.6 除菌过滤
  合并的培养液最后用0.22μm滤膜除菌过滤。此滤液即为原液。
  2.2.7 原液检定
  按3.1项进行。
  2.2.8 原液的保存及有效期
  原液置2~8℃保存,保存期为3个月,超过3个月应重新进行无菌检查。

  2.3 半成品配制
  2.3.1 配制
  用氯化钠调至等渗浓度,调pH值至6.0~7.5,肠毒素C含量为5~20ng/ml。
  2.3.2 半成品检定
  按3.2项进行。

  2.4 成品制备
  2.4.1 分批
  按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。
  2.4.2 分装
  按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。
  2.4.3 规格
  每支装量为2ml,肠毒素C含量应为5~20ng/ml。
  2.4.4 包装
  按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。

  3 检定
  3.1 原液检定
  3.1.1 肠毒素C含量测定
  按附录1法测定。含量应不低于5ng/ml。
  3.1.2 总蛋白含量
  按本版规程附录蛋白含量Lowry法测定,含量应不低于800μg/ml。
  3.1.3 无菌试验
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。

  3.2 半成品检定
  3.2.1 渗透压比值
  与0.9%生理氯化钠溶液的渗透压比值应为1.00±0.05。
  3.2.2 无菌试验
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.2.3 pH值
  应为6.0~7.5。

  3.3 成品检定
  3.3.1 鉴别试验
  按附录1法进行,结果应呈阳性,即供试品孔与对照孔的吸光度值比应不低于2。
  3.3.2 外观
  本品为淡黄色或无色液体,无沉淀、无异物。
  3.3.3 pH值
  应为6.0~7.5。
  3.3.4渗透压比值
  同3.2.1项。
  3.3.5 肠毒素C含量测定
  按附录1法测定。含量应为5~20ng/ml。
  3.3.6 T淋巴细胞增殖试验
  按附录2法进行。增殖指数应不低于1.5。
  3.3.7 无菌试验
  按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行,应符合规定。
  3.3.8 异常毒性试验
  按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行,应符合规定。
  3.3.9 热原质试验
  按本版规程通则《生物制品热原质试验规程进行》,注射剂量按家兔体重每1kg注射1.0ml,应符合规定。
  3.3.10 过敏试验
  取体重250~350g豚鼠6只,连续3次隔日腹腔注射本品0.5ml,分别于第一次注射后第14天及第21天静脉注射本品1.0ml,每次3只,在注射后30分钟内观察动物,不得有连续干咳、痉挛、休克、死亡等过敏症状,24小时内不得出现死亡。

  4 保存、运输及有效期
  于2~8℃避光保存和运输,自分装之日起有效期为2年。

  5 使用说明
  根据国家药品管理当局批准的内容及本版规程通则《生物制品包装规程》编写。

  6 附录
  附录1 肠毒素C含量测定法
  附录2 T淋巴细胞增殖试验


          附录1 肠毒素C含量测定法(ELISA法)

  本法采用酶联免疫法测定金黄色葡萄球菌滤液中肠毒素C含量。

  1 试剂
  1.1 包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液):称取碳酸钠159mg,碳酸氢钠293mg,加水溶解,定容至100ml。
  1.2 洗涤液(pH7.4PBS-Tween20):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29g,氯化钠80g,磷酸二氢钾2g,Tween-20 10ml,加水溶解并稀释至1000ml为浓缩液,临用前10倍稀释。
  1.3 酶标抗体稀释液(1%牛血清白蛋白、pH7.4):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)2.9g,氯化钠8g,磷酸二氢钾0.2g,氯化钾0.2g,Tween-20 0.5ml,加水溶解并稀释至1000ml,临用前,加牛血清白蛋白至终浓度为1%。
  1.4 底物溶解液:称取柠檬酸0.47g,磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)1.8g,加水溶解至100ml。
  1.5 底物液:称取邻苯二胺2mg,溶于底物溶解液5ml,加30%过氧化氢3μl,混匀。
  1.6 终止液:2mol/L硫酸。

  2 标准品溶液的配制
  用0.9%氯化钠溶液将肠毒素标准品稀释至20、16、12、8、4、2、1ng/ml。

  3 测定法
  用包被液将包被抗体稀释至5μg/ml后,以100μl/孔加至酶标板,4℃放置过夜。用洗涤液洗涤3次。或取包被好的酶标板,用洗涤液洗涤3次。将稀释好的标准品溶液及供试品加入酶标板,以同批次的培养基为阴性对照,每孔100μl,每个稀释度作双孔,37℃放置2小时。用洗涤液洗涤3次。用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释1000倍,以100μl/孔加至酶标板,37℃放置1.5小时。用洗涤液洗涤3次。加入底物溶液,100μl/孔,37℃显色10~15min后,加2mol/L硫酸50μl终止反应3分钟,在492nm波长下测定吸光度。

  4 结果计算
  以标准品的肠毒素C含量和对应的吸光度值进行直线回归,得直线回归方程。将供试品的吸光度值代入回归方程,即得供试品肠毒素C的含量。


              附录2 T淋巴细胞增殖试验

  1 试剂
  1.1 RPMI1640培养液(含10%胎牛血清) 取RPMI1640培养基干粉10.4g(规格为1L),加入1000ml超纯水溶解,再加入2.1g碳酸氢钠,4.77g羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),溶解后混匀,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。量取经过56℃、30分钟灭活的胎牛血清10ml,加入RPMI1640培养液90ml,4℃保存。
  1.2 Hank's液:取氯化钠80g、磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)0.6g、氯化钾4.0g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0g、葡萄糖10g、无水氯化钙1.4g,加水至1000ml为原液。配制时取原液100ml,加水896ml,加0.5%酚红4ml,混匀,经121℃、15分钟高压灭菌,4℃保存。临用前,加无菌7%碳酸氢钠溶液调pH7.2。
  1.3 磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、0.24g磷酸二氢钾,加水溶解并定容至1000ml,经121℃、15分钟高压灭菌。
  1.4 噻唑蓝(MTT)溶液:称取0.5gMTT溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS),使浓度为5mg/ml,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃避光保存。
  1.5 红细胞裂解液(Tris-NH4Cl):称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
  1.6 pH调节混合液:量取盐酸1ml、冰醋酸9.6ml加水13.4ml。
  1.7 甲瓒(Formazan)裂解液(SDS-DMF):量取二甲基甲酰胺(DMF)100ml,加水100ml配制成50%DMF(V/V)溶液,称取30g十二烷基硫酸钠(SDS)溶于200ml的50%DMF液,磁力搅拌,加pH调节混合液调pH为4.7。

  2 脾淋巴细胞悬液制备
  无菌条件下剖开小鼠(C57BL或纯系昆明小鼠,体重18-22g,雌雄不限。)腹腔取脾,研磨过100目筛网,Hank's液冲洗,收集分离的脾细胞悬液,1000r/min离心5分钟,弃上清;加红细胞裂解液10ml,混匀脾细胞,静止4-5分钟,待红细胞完全破碎,1000r/min离心5分钟,弃上清去除红细胞,Hank's液洗2-3遍,用RPMI1640培养液重悬细胞,计数调整细胞浓度为8-10×106个/ml。

  3 测定法
  96孔板上用RPMI1640培养液稀释供试品(设1∶1、1∶2、1∶4三个稀释度),每孔100μl,以生产用培养基为对照组,设3复孔,向各孔中分别加入100μl脾淋巴细胞悬液,37℃、5%CO2培养。72小时后,取培养板每孔加MTT液20μl,继续培养4小时,2500r/min离心10分钟,弃上清培养液,每孔加甲瓒裂解液100μl,待甲瓒沉淀溶解,在测定波长570nm,参比波长630nm下测定吸光度。

  4 结果计算
  淋巴细胞增殖指数=供试品组平均吸光度值/对照组平均吸光度值。

 


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